sds-聚丙烯酰胺凝膠-資料下載頁(yè)
2025-05-07 18:13本頁(yè)面
【正文】 . ? 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移并固定特定的固相支持物上 ,然后一特定的 ? 親和反應(yīng)、免疫反應(yīng)或結(jié)合反應(yīng)以及顯色系統(tǒng)分析此印跡 , ? 稱(chēng)為 Western印跡法 (Western Blot). ? 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移步驟 : ? . . 硝酸纖維膜 ? 重氮芐氨基甲基膜上 ? *固相載體 :用于吸附生物大分子物質(zhì)的固體材料 . ? 固相載體與蛋白質(zhì)結(jié)合方式 : ? (1)硝酸纖維膜 :非共價(jià)吸附 ? (2)重氮芐氨基甲基膜 :共價(jià)結(jié)合 ? Western印跡 : 鑒定蛋白質(zhì) 。 ? Western使用的探針是 抗體 ，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的 抗原表位 發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進(jìn)行鑒別和鑒定。 ? 步驟 : ? :蛋白質(zhì)行 SDSPAGE電泳并從聚丙烯酰胺凝膠上 ? 轉(zhuǎn)移至固相載體上 . ? :保持膜上沒(méi)有特殊抗體結(jié)合的場(chǎng)所 ,使場(chǎng)所處于飽 ? 和狀態(tài) ,用以保護(hù)特異性抗體結(jié)合到膜上并與蛋白 ? 質(zhì)反應(yīng) . ? (第一抗體 ):特異性 ? :與一抗特異性結(jié)合并作為指示劑 ? ? 封閉：用一種與待測(cè)物不反應(yīng)的物質(zhì) (如蛋白質(zhì)、 ? tween 20等 )封阻載體印跡區(qū)域以外的剩余 ? 吸附位點(diǎn) ,使探針與印跡反應(yīng) ,且不吸附到 ? 載體上 ,此過(guò)程稱(chēng)為封閉 . ? 封閉目的 :使印跡結(jié)果背景干凈 ,印跡的斑點(diǎn)或譜 ? 帶更為清晰 . ? *第一階段為 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPAGE)。 ? 抗原等蛋白樣品經(jīng) SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽(yáng)極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn) (只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶 )。 ? 第二階段為電轉(zhuǎn)移。 ? 將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓(100V)和大電流 (1—2A)，通電 45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。 ? 第三階段為 酶免疫 定位。 ? 將印有蛋白條帶的硝酸纖維素膜 (相當(dāng)于包被了抗原的固相載體 )依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的 HRP底物為 3， 3， —二氨基聯(lián)苯胺(呈硝酸纖維素膜棕色 )和 4—氯 —1—萘酚 (呈藍(lán)紫色 )。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù) SDSPAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。 ? 優(yōu)點(diǎn) : ? ? ,可在膜上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多種檢測(cè)和鑒定 . ? 例 :放射自顯影、染色、酶標(biāo)免疫等 ? ? 應(yīng)用： ? ? ? 同一蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或統(tǒng)一細(xì)胞不同條件 ? 下的相對(duì)含量分析 . ?
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