生化大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳-資料下載頁(yè)
2025-05-14 22:11本頁(yè)面
【正文】 4. 樣品的處理及加樣 將樣品按 –1 mg/mL加樣品溶解液，溶解后，將其轉(zhuǎn)移到帶塞的小離心管中，輕輕蓋上蓋子 (不要塞緊，以免加熱時(shí)迸出 )，在 100℃ 沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。 用微量進(jìn)樣器取 25 ?l上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。 5 .電泳 蓋上電泳槽蓋子，將電泳儀的正極與電泳槽紅色連線連接，負(fù)極與黑色連線連接，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為 10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至2030 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框 1 cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源。 6 .染色與脫色 電泳結(jié)束后 ， 取下凝膠模 ， 卸下硅膠框 ， 用棕色梳撬開(kāi)短玻璃板 ， 從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記 ， 加入染色液染色 1 h， 再用脫色液脫色過(guò)夜 ， 直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰 ， 即可觀察蛋白質(zhì)純度或計(jì)算相對(duì)遷移率 。 7. 結(jié)果觀察與處理： 量出加樣端距電泳溴酚蘭前沿的距離 (cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離 (cm)， 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率 mR: 相對(duì)遷移率 mR= 蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離 (cm) 溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離 (cm) 六 、 注意事項(xiàng) （ 1） 安裝電泳槽時(shí)要注意均勻用力旋緊固定螺絲 （ 對(duì)角旋緊 ） ， 避免緩沖液滲漏 。 （ 2） 上層濃縮膠聚合快 ， 加入 10%APS后快速混勻 ，及時(shí)轉(zhuǎn)移至玻板之間 ， 并快速插入十孔梳 ， 以免樣品孔變形 。 （ 3）加樣時(shí)樣品不能超出凹形樣品槽。加樣槽中不能有氣泡，如有氣泡，可用注射器針頭挑除。 七 、 復(fù)習(xí)題 ? 影響電泳的主要因素有哪些？ ? 什么是聚丙烯酰胺凝膠電泳 ？ ? 聚丙烯酰胺凝膠聚合時(shí)自由基的引發(fā)有哪兩種方法？ ? 不連續(xù)凝膠電泳的分離原理。 ? 請(qǐng)說(shuō)出常用蛋白質(zhì)染色的幾種方法 。 ? 請(qǐng)說(shuō)出常用脂蛋白染色方法。 ? SDS在 SDSPAGE中的作用。 ? 請(qǐng)敘述一下血漿載脂蛋白 B100的分離純化過(guò)程。 ? 蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法有哪些？簡(jiǎn)述其原理。 ? 雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定 LDL純度原理。
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