聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳-資料下載頁
2025-05-12 21:19本頁面
【正文】 出樣品槽模板，在小加樣槽中加入 5~10 181。L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)； ③ 用滴管將已加熱融化的用電極緩沖液配制的 1％瓊脂快速加在濃縮膠上，使瓊脂在濃縮膠上鋪開形成一層水平的膠層，瓊脂高度為 1~2 mm； ④ 待瓊脂凝固，將放著膠條的玻璃板靠近短板，使膠條滑入槽內(nèi)，平鋪在瓊脂上，將膠條與瓊脂膠緊密結(jié)合； ⑤ 用滴管加融化的瓊脂于膠條上，使到達(dá)短板上沿，將膠條包埋； ⑥ 滴加融化的瓊脂到玻璃板與冷卻槽交接處，密封上槽。 (7)電泳 將電泳裝置放入電泳槽中，在上槽中灌入電極緩沖液，緩沖液高過短板，其余緩沖液到入下槽，應(yīng)高過凝膠板下沿 2 cm。蓋上電泳槽蓋子，接通電源，恒壓 60V，電泳 30 min，樣品進(jìn)入凝膠后，調(diào)節(jié)恒壓 250V，電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部 1cm左右時(shí)停止。 (8)固定 倒去電極緩沖液，拆開電泳槽，取下凝膠板，放入固定液中，室溫過夜。 (9)染色和脫色 用考馬斯亮藍(lán) R250染色液染色 2 h，用脫色液脫色，直至背景清晰。 (10)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 凝膠掃描。 蛋白質(zhì)銀染色技術(shù) 準(zhǔn)備試劑 甲醇、 1000ml 冰醋酸、 500ml 甲醛 100ml DTT 500mg AgNO3 5000mg Na2CO3 60g 試劑配制（每個(gè)組） (1) 40％甲醇－ 10％冰醋酸 150ml。 (2) 10％甲醇 5％冰醋酸 150ml。 (3) 5μg/ml的 DTT溶液 150ml。 (4) ％ AgNO3溶液 150ml。 (5) 3％ Na2CO3溶液 150ml。 (6) 3％ Na2CO3溶液（內(nèi)含 60100μl/100ml甲醛） 150ml。 (7) 5％的冰醋酸溶液 150ml。 3\操作步驟 ① 將膠置于 150ml 40％甲醇－ 10％冰醋酸中浸泡，搖動(dòng)固定過夜。 ② 取出膠，置于 120ml 10％甲醇 5％冰醋酸中浸泡，搖動(dòng)固定 30min。 ③ 用去離子水將膠浸泡、漂洗，第一、二次，每次間隔20min。 ④ 去離子水搖動(dòng)漂洗，第三、四次，每次間隔 30min換水一次。 ⑤ 傾出去離子水，加入 5μg/ml的 DTT溶液 120ml，搖動(dòng)浸泡 30min。 ⑥ 用去離子漂洗一次，然后將膠放在 120ml ％AgNO3中浸泡 30min。 ⑦ 用大量的去離子水將膠漂洗約 23min。 ⑧ 將凝膠放入 120mL 3％ Na2CO3溶液中浸泡 35min。 ⑨ 將凝膠放在 3％ Na2CO3溶液（內(nèi)含 120μl/120ml甲醛，可根據(jù)情況增減）的顯影液中顯影。 ⑩ 等蛋白斑點(diǎn)清楚后，將膠放在 5％的冰醋酸溶液中10min停止反應(yīng)。用蒸餾水將膠漂洗干凈。
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