聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳(已修改)
2025-05-28 21:19 本頁面
【正文】 聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳 第一部分 實驗簡介 一、實驗目的 通過雙向電泳實驗，初步掌握電泳的基本理論、雙向電泳實驗的設計原理和實驗技能。 二、實驗原理 根據(jù)不同的蛋白質具有不同的分子量和等電點的特點。利用這一性質首先通過毛細管聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦技術將不同等電點的蛋白質分開，然后通過 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳將相同或相近等電點而分子量不同的蛋白質進行相對分子量分離。經(jīng)過二維電泳分離的蛋白質在二維電泳圖譜所處的位置，就是該蛋白質的相對分子量和等電點。 三、 實驗流程 蛋白樣品的制備 ↓ 等電聚焦凝膠溶液的配制 ↓ 灌注毛細管凝膠 ↓ 組裝第一向電泳槽 ↓ 聚焦電泳 ↓ 停止電泳 ↓ 取出毛細管膠 ↓ 毛細管膠置平衡液中平衡 ↓ 組裝第二向電泳槽 ↓ 配制 SDS丙烯胺凝膠溶液 ↓ 灌裝 SDS電泳膠 ↓ 第一向凝膠與第二向凝膠拼接 ↓ 接通電源進行 SDS電泳 ↓ 停止電泳取膠 ↓ 凝膠置固定液中固定 ↓ 銀染法顯色 ↓ 結果分析 第二部分 實驗方法 第一向電泳 —— 毛細管等電聚焦電泳（ IEF） 雙向電泳系統(tǒng)一套 （ 見清單 ） 燒杯 1000 mL 、 50 mL 各 1個 量筒 1000 mL （ 或 500 mL） 、 100 mL 、 10 mL各 1個 注射器 1 mL（ 帶長針頭 ） 、 微量注射器 100μL（ 或 50μL）各 1支 大塑料盒 1個 滴管 1支 2．溶液配制 (1)覆蓋溶液（ 25 mL/班） 含 8 mol/L尿素， 1%兩性電解質 pH 3~， 5% (w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute)和 100 mmol/L DTT 取 12 g尿素， mL兩性電解質 (pH 3~)， mL的10%的 NP40和 g DTT，用重蒸水溶解后，定容到25mL。溶液不能受熱 ,儲存在冰箱中。 (2)平衡溶液（ 250 mL/班） TrisHCl( pH )緩沖液，含2% SDS， 100 mmol/L DTT和 10%甘油 15 mL TrisHCl(pH )， 50 mL 10%SDS， g DTT和 29 mL甘油，用重蒸水定容到 250 mL
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