聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳-閱讀頁
2025-06-01 21:19本頁面
【正文】 分離膠緩沖液 /mL 重蒸水 /mL 10% SDS /mL TEMED /181。L 30 30 30 總體積 /mL 12 12 12 (3)灌注分離膠 首先將配制的第一層凝膠溶液用滴管沿著長玻璃板內(nèi)側(cè)緩緩加入凝膠腔，小心不產(chǎn)生氣泡，然后用少量 1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（高度約 2 mm），凝膠聚合大約 30min。 凝膠聚合后灌注第三層凝膠溶液，最終凝膠距離短玻璃板上沿 3 cm左右 , 最后用 1/4濃度的分離膠緩沖液封膠面（約 20 mm）。濃縮膠溶液配制方法見表 3。L 30 10% AP /181。 (6)凝膠拼接 ① 將平衡好的膠條用少量的電極緩沖液漂洗，擺放在一塊干凈的玻璃板上，膠條的正極端位于小加樣槽一端。L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)； ③ 用滴管將已加熱融化的用電極緩沖液配制的 1％瓊脂快速加在濃縮膠上，使瓊脂在濃縮膠上鋪開形成一層水平的膠層，瓊脂高度為 1~2 mm； ④ 待瓊脂凝固，將放著膠條的玻璃板靠近短板，使膠條滑入槽內(nèi)，平鋪在瓊脂上，將膠條與瓊脂膠緊密結(jié)合； ⑤ 用滴管加融化的瓊脂于膠條上，使到達(dá)短板上沿，將膠條包埋； ⑥ 滴加融化的瓊脂到玻璃板與冷卻槽交接處，密封上槽。蓋上電泳槽蓋子，接通電源，恒壓 60V，電泳 30 min，樣品進(jìn)入凝膠后，調(diào)節(jié)恒壓 250V，電泳至溴酚蘭到達(dá)分離膠底部 1cm左右時停止。 (9)染色和脫色 用考馬斯亮藍(lán) R250染色液染色 2 h，用脫色液脫色，直至背景清晰。 蛋白質(zhì)銀染色技術(shù) 準(zhǔn)備試劑 甲醇、 1000ml 冰醋酸、 500ml 甲醛 100ml DTT 500mg AgNO3 5000mg Na2CO3 60g 試劑配制（每個組） (1) 40％甲醇－ 10％冰醋酸 150ml。 (3) 5μg/ml的 DTT溶液 150ml。 (5) 3％ Na2CO3溶液 150ml。 (7) 5％的冰醋酸溶液 150ml。 ② 取出膠，置于 120ml 10％甲醇 5％冰醋酸中浸泡，搖動固定 30min。 ④ 去離子水搖動漂洗，第三、四次，每次間隔 30min換水一次。 ⑥ 用去離子漂洗一次，然后將膠放在 120ml ％AgNO3中浸泡 30min。 ⑧ 將凝膠放入 120mL 3％ Na2CO3溶液中浸泡 35min。 ⑩ 等蛋白斑點清楚后，將膠放在 5％的冰醋酸溶液中10min停止反應(yīng)。
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