生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)8聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳-資料下載頁(yè)
2025-01-16 13:02本頁(yè)面
【正文】 20%甘油， %溴酚藍(lán)， mol/L TrisHCl 緩沖液） 5 .電泳 將電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)電流為 10 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至 2030 mA，當(dāng)溴酚藍(lán)染料距硅膠框 1 cm時(shí)，停止電泳，關(guān)閉電源及冷卻水。 6 .染色與脫色 電泳結(jié)束后 ， 取下凝膠模 ， 卸下硅膠框 ， 用不銹鋼藥鏟或鑷子撬開(kāi)短玻璃板 ， 從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記 。 加入染色液染色 12 h， 再用脫色液脫色 ， 直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰 ， 即可觀察結(jié)果及計(jì)算相對(duì)遷移率 。 7. 結(jié)果處理 1） 觀察記錄電泳結(jié)果 2） 量出加樣端距溴酚蘭的距離 (cm)以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離 (cm)， 按下式計(jì)算相對(duì)遷移率 mR: 相對(duì)遷移率 mR= 蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離 (cm) 溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離 (cm) 六 、 注意事項(xiàng) （ 1） 用瓊脂 (糖 )封底及灌膠時(shí)不能有氣泡 ， 以免電泳時(shí)影響電流的通過(guò) 。 （ 2） 加樣時(shí)樣品不能超出凹形樣品槽 。 加樣槽中不能有氣泡 ， 如有氣泡 ， 可用注射器針頭挑除 。 （ 3）如加樣孔界限不是很清晰，可在樣品梳取出前用記號(hào)筆做上記號(hào)。 （ 4）電泳儀不能空載。 （ 5）電泳時(shí)不要用手接觸電極緩沖液 七 、 思考題 (1)為什么要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的蔗糖溶液 ？ 蔗糖及溴酚蘭的作用分別是什么 ？ ? 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) 1．原理 聚丙烯酰胺等電聚焦電泳 (Isoelectric FocusingPAGE，簡(jiǎn)稱(chēng) IEFPAGE)：利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體 (carrier ampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自 pI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的 pH梯度。在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在此 pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至 pH值等于 pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。 兩性電解質(zhì)載體 (carrier ampholytes) (1)易溶于水 ， 在 pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力 ， 形成穩(wěn)定的 pH梯度 ， 不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度 。 (2)在 pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù) ， 以保持均勻的電場(chǎng) 。 (3)分子量小 ， 可通過(guò)透析或分子篩法除去 ， 便于與生物大分子分開(kāi) 。 (4)化學(xué)性能穩(wěn)定 ， 與被分離物不起化學(xué)反應(yīng) ， 也無(wú)變性作用 ， 其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì) 。 IEFPAGE分離蛋白質(zhì)并測(cè)定 pI 返回 雙向電泳（ 2DPAGE）
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