生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)8聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳(編輯修改稿)
2025-02-12 13:02 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 HC1。電極緩沖液是 Tris甘氨酸緩沖液。 2種孔徑的凝膠、 2種緩沖體系、 3種 pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。 （ 1） 樣品濃縮效應(yīng) (a)凝膠孔徑不連續(xù)性： (b)緩沖體系離子成分及 pH值的不連續(xù)性； ? 在 前導(dǎo)離子或快離子： HC1解離出的氯根 (C1) 尾隨離子 (trailing ion)或慢離子：甘氨酸根 mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根 ， P代表蛋白質(zhì) ， G代表甘氨酸根 )有效遷移率 =m?， m為遷移率 ， ?為解離度 ) ? 當(dāng)進(jìn)入 ， 甘氨酸解離度增加 ， 其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì)； （ c)電位梯度的不連續(xù)性： (2)分子篩效應(yīng) (3)電荷效應(yīng) 圖 4 電泳過(guò)程示意圖 A為電泳前 3層凝膠排列順序， 3層膠中均有快離子，慢離子 B顯示電泳開(kāi)始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。 C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個(gè)區(qū)帶。 圖 5 不連續(xù)系統(tǒng)濃縮效應(yīng)示意圖 ? SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí) ， 它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素 。 如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡(jiǎn)稱(chēng) SDS)， 則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量 ， 而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān) 。 因此可以利用 SDSPAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量 。 ? 在蛋白質(zhì)溶液中加入巰基乙醇后，巰基乙醇能使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使蛋白質(zhì)分成單個(gè)亞單位； ? SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì) – SDS復(fù)合物。由于 SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，使各種蛋白質(zhì)的 SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷。 ? SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。不同蛋白質(zhì)的 SDS復(fù)合物的短軸長(zhǎng)度一樣，約為 18197。，而長(zhǎng)軸則隨蛋白質(zhì)的分子量成正比地變化。 ? 由于蛋白質(zhì)的遷移率與蛋白質(zhì)的凈電荷量 (q)成正比，與蛋白質(zhì)在溶液中的摩爾系數(shù) (f)成反比 (f由介質(zhì)的粘滯性、蛋白質(zhì)分子的大小和形狀決定 )，而不同的SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，并具有相同形狀；因此在一定濃度的凝膠中，由于分子篩效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。 三、試劑與器材 試劑： 10%SDS、 凝膠貯液（ 30％ %Bis)、分離膠緩沖液（ mol/L － HCl 緩沖液）、 濃縮膠緩沖液（ mol/L － HCl 緩沖液）、 10%過(guò)硫酸銨、 10%TEMED、 、 1%瓊脂糖溶液、 ％考馬斯亮蘭 R250 、 7%醋酸 器材：雙垂直板電泳槽、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳
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