過氧化物酶(pod)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳-資料下載頁
2025-08-18 17:05本頁面
【正文】 點樣前,要對樣品進行預(yù)處理,即把粗酶提取液與甘油溴酚藍(lán)指示劑以4:1混合,用50μl的微量點樣器吸取樣品20μl,將點樣器的針頭小心插入到點樣孔底部,慢慢注入樣品,要注意防止漂樣。點樣完畢后,連接好導(dǎo)線(正負(fù)電極不要接反,紅色為正極,黑色為負(fù)極),將電壓調(diào)至70 V,當(dāng)溴酚藍(lán)標(biāo)志線移至濃縮膠與分離膠分界處,將電壓調(diào)至150V,電泳23小時,當(dāng)溴酚藍(lán)標(biāo)志線剛好跑出膠板時,結(jié)束電泳。切斷電源,取出緩沖液并低溫保存,可重復(fù)使用2次。然后松開卡板，取出凝膠板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分離膠的一角),輕輕撬去一塊玻板,用刀切掉分離膠右下角以示點樣順序,輕輕撬起分離膠,使之滾入染色培養(yǎng)皿中。POD染色步驟如下：先用自來水溶液潤洗兩遍,再加入3040mL的染色液,室溫下放置520min,至顯色完全。、膠皮、電泳槽。五、注意事項：，以免將玻璃板弄碎。同時，清洗玻璃板不容許用強酸、強堿以及酒精溶液，一般用清水加一點洗滌劑進行清洗，然后用去離子水或蒸餾水潤洗。，要注意實驗安全，凝膠、聯(lián)苯胺等試劑有毒，應(yīng)戴乳膠手套或一次性手套操作。，以免觸電。附表1試劑 配方分離膠PAG溶液 丙烯酰胺 (Acr):30g N,N亞甲基雙丙烯酰胺(Bis): 加水定容至100mLTrisHCl緩沖液() Tris:36g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至100mL濃縮膠PAG溶液 Acr: Bis: 加水定容至50mLTrisHCl緩沖液() Tris:3g HCl(12mol/L):2mL 加水定容至50mL 40%蔗糖溶液 蔗糖:20g 加水定容至50mL10% TEMED 溶液 四甲基乙二胺(TEMED):10mL 加水定容至100mL(避光、低溫保存)10%過硫酸胺(AP)溶液 AP: H2O:5mL (避光、低溫保存,一周內(nèi)可多次使用)甘油溴酚藍(lán)指示劑 溴酚藍(lán): H2O:5mL 甘油:5mL電極緩沖液(pH ) Tris: 甘氨酸(Gly): 加水定容至1000mL,使用時稀釋10倍() 按照有關(guān)參考書配置
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