過氧化物酶(pod)同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳(文件)
【正文】 完畢后,連接好導(dǎo)線(正負(fù)電極不要接反,紅色為正極,黑色為負(fù)極),將電壓調(diào)至70 V,當(dāng)溴酚藍(lán)標(biāo)志線移至濃縮膠與分離膠分界處,將電壓調(diào)至150V,電泳23小時(shí),當(dāng)溴酚藍(lán)標(biāo)志線剛好跑出膠板時(shí),結(jié)束電泳。、膠皮、電泳槽。，以免觸電。同時(shí)，清洗玻璃板不容許用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及酒精溶液，一般用清水加一點(diǎn)洗滌劑進(jìn)行清洗，然后用去離子水或蒸餾水潤(rùn)洗。然后松開卡板，取出凝膠板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分離膠的一角),輕輕撬去一塊玻板,用刀切掉分離膠右下角以示點(diǎn)樣順序,輕輕撬起分離膠,使之滾入染色培養(yǎng)皿中。在濃縮膠聚合完畢后,小心取出梳子,兩拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指頂住制膠框兩側(cè),勻速地拔出梳子,然后向電泳槽中倒入預(yù)冷的電極緩沖液（原液要稀釋10倍）,緩沖液要沒過低板。B、充分混勻的（分離膠或濃縮膠）溶液應(yīng)盡快用移液槍延高板的一側(cè)慢慢加入膠板中C、膠制作完成后，松開卡板取下橡膠皮，然后再用卡板卡緊膠板。再靜置40min左右,讓分離膠凝聚完全。試劑：電泳試劑貯存液配置見附表(附表1)。本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)，分離、鑒定土豆、豆芽過氧化物酶同工酶。過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。于是，此后的電泳過程中，酶蛋白在一個(gè)均一的電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)而被分離。本來夾在快慢離子之間的酶蛋白區(qū)帶，在這個(gè)追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區(qū)帶。其遷移率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。待分離的酶蛋白樣品加在樣品槽中。其原因如下：① 由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。下面以本實(shí)驗(yàn)要分離的豆芽或土豆過氧化物酶同工酶為例，分別說明三種效應(yīng)的作用：（1）電荷效應(yīng)：各種酶蛋白按其所帶電荷的性質(zhì)及數(shù)量，在電場(chǎng)作用下向一定電極，以一定速度泳動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)采用堿性系統(tǒng)。把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用樣品被濃縮成一個(gè)狹窄的區(qū)帶，使樣品組分在分離膠中得以高分辨率的被分離。 2～不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1）凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。 105～2106 酸 4104～1105＜104％濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)，%的分離核酸。聚丙烯酰胺凝膠的質(zhì)量主要由凝膠濃度和交聯(lián)度決定。聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)，為丙烯酰胺單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起。在催化劑TEMED的作用下，由過硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。引發(fā)產(chǎn)生自由基團(tuán)的方法有兩種，即化學(xué)法和光化學(xué)法。甲叉雙丙烯酰胺（N,N39。在稀溶液中，離子強(qiáng)度Ⅰ可用下式計(jì)算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3)（3)式中，mi為
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