綜合性實驗蛋白質(zhì)的分離提取、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳及westen印跡-資料下載頁
2025-10-08 02:24本頁面
【正文】 ：蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS PAGE），并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（ Nitrocellulose，簡稱 NC）簿膜上。 封閉 ：用牛血清白蛋白或脫脂奶粉封閉膜，主要目的是為了減少特異抗體對膜上其它部位的非特異性吸附。 第一抗體結(jié)合 ：是特異性的。 第二抗體結(jié)合 ：對于第一抗體是特異性的并作為指示物。 被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)條帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。 Western blot 三、操作步驟 先從玻璃板內(nèi)取出凝膠，將凝膠在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡一下（先把 Whatman 3MM濾紙及硝酸纖維素薄膜在電轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡 10分鐘），按照下圖所示夾心方法把 Whatman 3MM濾紙、凝膠、硝酸纖維素薄膜、石墨板依順序放好，操作時注意驅(qū)趕氣泡。電轉(zhuǎn)移條件為常溫 1Am/cm2 恒流約 hr。 15層濾紙 凝膠 15層濾紙 NC膜 石墨板 石墨板 （ 1） 蛋白質(zhì)電泳 ? 常用 SDSPAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì) ? 非變性 PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) ? TrisTricine膠中電泳：用于分子量小于 10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。 ? 戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉(zhuǎn)印。 濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 ? 以適量的轉(zhuǎn)移 Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜 15－ 30min，如果是 PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。 ? 方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極。 ? 排去濾紙、膠和膜間的氣泡。 ? 電轉(zhuǎn)時間： 100V 12h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇 ? 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率。 ? 膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。 （ 2）轉(zhuǎn)膜 （ 3）封閉 ? 用 5％脫脂奶粉或 3％ BSA （含 ％ Tween20 TBS或 PBS配制） ? 時間：室溫 2h或 4186。C過夜 （ 4）顯色或顯影 ? 顯色 辣根過氧化物酶：底物為 DAB 堿性磷酸酶：底物為 BCIP/NBT ? 化學(xué)發(fā)光顯影 最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品） ? 注意：化學(xué)發(fā)光前將膜用不含 Tween20的 TBS或 PBS洗滌一次 曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定 ? 化學(xué)發(fā)光后的硝酸纖維素膜用 Stripping Buffer洗滌后（洗滌 Buffer: 的 TrisHCI含 2％ SDS和100mm的 ? － 2ME ） 用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復(fù)使用 3－ 4次。 ? 堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交 （ 5）膜的再利用 （四）免疫學(xué)檢測 將轉(zhuǎn)移好的硝酸纖維素薄膜于 ddH20中浸洗數(shù)次，取 1毫升 10倍濃度的麗春紅 S溶液，加 9毫升的 ddH2O混勻，于一相當(dāng)于膜大小的染色皿中，小心將薄膜轉(zhuǎn)移于染色皿內(nèi)，其內(nèi)輕搖動染色液，染色 310 min。然后倒棄染色液，加入少許 ddH2O漂洗數(shù)次，用鉛筆標(biāo)出分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶與陽性對照條帶。 用 ddH2O漂洗后，將硝酸纖維素薄膜置于封閉緩沖液，室溫封閉 : 37℃ 反應(yīng)約 hr，以封閉未吸附蛋白的部位。 取出膜，將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當(dāng)稀釋的第一抗體37℃ 反應(yīng)約 hr，其間不停地在搖床上晃動。 取出膜，將硝酸纖維素薄膜在清洗緩沖液中晃動清洗 30分鐘，每 5 min換一次清洗緩沖液， 取出膜，將硝酸纖維素薄膜與用封閉緩沖液適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)記第二抗體 37℃ 反應(yīng)約 hr，其間不停地在搖床上晃動。 用 50mM TrisHCl 3次。 加入 DAB溶液，顯色 5～ 10min，出現(xiàn)棕色帶者為陽性，用自來水沖洗以終止酶的反應(yīng)。保存硝酸纖維素薄膜或拍照作記錄。 四、結(jié)果 如果所檢測特異性蛋白存在，則會出現(xiàn)相應(yīng)條帶 。 五、應(yīng)用意義 Western blotting是用于分離蛋白質(zhì)的一種成熟的方法，它廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)特征和結(jié)構(gòu)的研究。
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