雙向凝膠電泳ppt課件(2)-wenkub
2023-05-18 18:46:47 本頁面
【正文】 備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。 隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向 聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。 1969年，雙向凝膠電泳 在原理上有了新的發(fā)展，以第一向為蛋白質(zhì)等電聚焦的雙向 凝膠電泳建立起來 (即 IEFPAGE)。 ? 防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。 可溶性樣品 固體組織樣品 細(xì)胞 不同樣品的基本處理方法 樣品的分級處理 通過采用亞細(xì)胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。 增加樣品溶解性的手段 變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其中 CHAPS和 SB310最好。 Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。 樣品中核酸的去除 ? 對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。 現(xiàn)常用預(yù)分級＋窄 pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群 ， 再用 pH梯度小于 2個pH單位的 IPG膠進(jìn)行窄 pH范圍的分離 。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。 Immobilized pH Gradient (IPG) IPG膠條的重泡脹 ? 泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入 IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的 IEF 常用的泡脹液的成分為 8M尿素， 2％的去污劑（ NP40,Triton X100,CHAPS),15mM DTT,% IPG buffer 蛋白載樣量 影響 IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括： ? 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。 ? IPG膠條的 pH范圍 IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。 ? 過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 ? 但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而在 SDSPAGE是電泳能順利進(jìn)行。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在 IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性 IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。 ? 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實驗室 300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存 ， 其線性范圍為 3個數(shù)量級 。 ? 速度快 （ 5~15min） ， 蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 ? 最好的膠體金染色的靈敏度與 PAGE膠內(nèi)的銀染類似。 ? 其中 SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料 。 C for 1624 hours EXTRACT ? Soak slices 50% acetonitrile with 5% TFA ? Transfer supernatant to new plate or tube ? Extract slices again and bine supernatants DRY ? Speedvac or lyophilize bined supernatants to plete dryness ? Reconstitute dried samples in 50% acetonitrile with % TFA RECONSTITUTE ? 非變性 2DPAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行 ， 這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； ? 非變性 /SDS2DPAGE：第一向采用非變性 IEF， 之后在 2%SDS溶液中平衡；第二向也在 SDS存在的條件下進(jìn)行 。 ? 變性 2DPAGE：樣品先用 2%SDS＋ 5%βME＋ 95℃ 變性 5min，IEF在 8M尿素＋ 1%NP40條件下進(jìn)行 ， 之后膠條用 2%SDS＋5%βME平衡 ， 然后進(jìn)行 SDSPAGE。 ?所得到的 2D
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