雙向電泳技術(shù)ppt課件-wenkub
2023-05-27 06:43:05 本頁(yè)面
【正文】 的 pH梯度。如果烴鍵靠近在高度聚合的位置，酰胺基也會(huì)受到分子間的縮聚作用而成亞胺橋。 ?與一些羥基化合物如酚或酯族醇反應(yīng)，生成 β 芳氧基或烷氧基丙酰胺。 加速劑四甲基乙二胺 (TEMED)的堿基可使催化劑過(guò)硫酸銨(簡(jiǎn)稱(chēng) AP)的水溶液產(chǎn)生出游離氧原子，然后激活 Acr單體，形成單體長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑 Bis作用下聚合成網(wǎng)狀的凝膠。 ?在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無(wú)色透明，有彈性，機(jī)械性能好，易觀察。 PAGE應(yīng)用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定分子量、等電點(diǎn)等。 9 ?? 另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同 ， 區(qū)帶電泳可分為 ：薄層電泳 、 板電泳 、 柱電泳 。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 ??? 以上二種類(lèi)型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。 5 二、影響電泳速度的因素 電場(chǎng)強(qiáng)度； 緩沖溶液的 pH； 緩沖溶液的離子強(qiáng)度； 電滲； 焦耳熱 三、電泳的分類(lèi) 按原理分類(lèi)： 自由界面電泳 ：又稱(chēng)移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。 蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。 *由 80年代發(fā)展起來(lái)的新的毛細(xì)管電泳技術(shù)，是化學(xué)和生化分析鑒定技術(shù)的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。 *1937年瑞典 Uppsala大學(xué)的 Tiselius對(duì)電泳儀器作了改進(jìn)，創(chuàng)造了 Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動(dòng)界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及 α 、 β 、 γ 球蛋白組成的，由于 Tiselius在電泳技術(shù)方面作出的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)而獲得了 1948年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1 第三章 雙向電泳技術(shù) 2 *1809年俄國(guó)物理學(xué)家 Peй ce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。 *1948年 Wieland和 Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對(duì)氨基酸的分離進(jìn)行過(guò)研究。 *雙向電泳由 O’Farrell’s于 1975年首次建立并成功地分離約 1000個(gè) 蛋白。其泳動(dòng)速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類(lèi)型。 8 ③ 淀粉凝膠電泳 ：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。 ⑤ 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。 ?? 根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。 11 丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)： ①幾乎無(wú)電滲作用。 ?凝膠孔徑可調(diào)。 ②核黃素 TEMED：光聚合作用。 ?在 20℃ 能 NH3反應(yīng)，生成 β 、 β′ 、 β″ 氮川三丙酰胺。 16 凝膠的孔徑可調(diào)性及其他性質(zhì) ?每 100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱(chēng)凝膠濃度，用 T%表示； T% = (a+b)/m ?a：丙烯酰胺克數(shù)； b： N,N甲叉雙丙烯酰胺克數(shù)； m：緩沖液體積 (毫升 )。蛋白進(jìn)入時(shí)，不同的蛋白移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)?pH位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白得以分離。分析對(duì)象只限于蛋白質(zhì)和其他兩性分子。 23 聚焦效應(yīng) 等電聚焦的分辨率 24 二、載體兩性電解質(zhì) pH梯度等電聚焦電泳 載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的條件 ① 在等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力，以便能控制 pH梯度，而不致被樣品的緩沖能力而改變 pH梯度。 ⑤ 應(yīng)不與分離物質(zhì)反應(yīng)或使之變性。 利用載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下自然形成 pH梯度，常用該方法。 等電聚焦中應(yīng)注意的事項(xiàng) ① pH梯度的選擇； ② 添加中性載體兩性電解質(zhì)； ③ 電流降到最小切恒定時(shí)盡快結(jié)束 IEF。 27 三、固相 pH梯度等電聚焦電泳技術(shù) 固相 pH梯度等電聚焦是 80年代建立起來(lái)的一種等電聚焦技術(shù)。 Immobilines（固相試劑）是一系列性質(zhì)穩(wěn)定的具有弱酸弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺有類(lèi)的聚合行為。分子另一端的 R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段 pH范圍就可形成近似線(xiàn)性的分布在 pH3～ 10范圍的緩沖體系。 注意事項(xiàng) ：溫度： 2030℃ ； 電壓：梯度上升。 ② 加入 SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇使蛋白的二硫鍵還原，SDS使氫鍵、疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到 P分子上，形成蛋白 SDS，帶上相同密度負(fù)電荷，形狀為長(zhǎng)橢圓形，短軸一定，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度正比于蛋白分子量。 此時(shí)分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取 、 蛋白酶消化 、 MALDITOFMS分析鑒定 ， 提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息 。通過(guò)這種方式生成的 IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的 IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。 ? 待研究蛋白的豐度： ? 樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。 ? 聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 保存數(shù)月。 54 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類(lèi)似。 ?
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