雙向電泳技術(shù)ppt課件(參考版)
2025-05-15 06:43本頁面
【正文】 61 第五節(jié) 電泳過程中出現(xiàn)的問題及解決辦法 一、第一向等電聚焦的問題 ① 固相 pH梯度膠條在靠近電極附近燒焦 ② 電壓太低，達(dá)不到最高電壓 ③ 電流為零或很低 ④ 脲在膠條表面結(jié)晶 62 二、第二向 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的問題 ① 開始時(shí)沒有電流，電泳太慢 ② 溴酚藍(lán)前沿不規(guī)則 三、染色的問題 ① 水平條紋 ② 垂直條紋 ③ 點(diǎn)紋理 63 凝膠的圖像處理分析和 典型流程 ? 凝膠圖像的掃描： ? 圖像加工： ? 斑點(diǎn)檢測和定量： ? 凝膠配比： ? 數(shù)據(jù)分析： ? 數(shù)據(jù)呈遞和解釋： ? 2DE數(shù)據(jù)庫的建立： 64 蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切 包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過程 65 質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程 樣品制備 與 IPG膠條水化 IPG電泳 與上樣緩沖液浸潤 SDSPAGE 轉(zhuǎn) PVDF膜 膠內(nèi)直接染色 染色 取出蛋白點(diǎn) 胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上 MALDIMS肽指紋圖 數(shù)據(jù)庫查詢 蛋白質(zhì)鑒定 已知 反向 HPLC分離 MALDIMS，PSD片段分析 示知 ESIMSMS、微測序 66 實(shí)驗(yàn)方法 完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)） 肽混合物 質(zhì)譜測定肽質(zhì)量 （ MALDIMS,ESIMS) 選擇肽段裂解 PSDMALDIMS,ESIMS/MS) 計(jì)算方法 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫） 肽質(zhì)量檢索： 片 未解析碎片離子檢索：片 酶切 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略 67 體外 pmol [32P]蛋白質(zhì)標(biāo)記 蛋白質(zhì)分離 蛋白酶切 2D磷酸化做圖 ?LCESIMS或 MALDIMS ?LCESIMS ?HPLC IMAC 磷酸化氨基酸分析 體內(nèi) [32P]細(xì)胞標(biāo)記 蛋白酶切 2D磷酸化做圖 相關(guān)分析 磷酸化位點(diǎn)分析策略 。 它們不包含戊二醛 、 甲醛或Tween20等 ， 很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺（ 包括自動(dòng)化凝膠染色儀 、 圖像分析工作站 、 機(jī)器人剪切儀器 、 蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等 ） 相結(jié)合 。 ? 在 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后 ， 蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或 Edman測序來鑒定蛋白質(zhì) 。 染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室 300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存 ， 其線性范圍為 3個(gè)數(shù)量級 。 后者最為常用 ， 其典型代表是已經(jīng)商品化的 SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 。 ? 這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。 58 膠體擴(kuò)散染料 ? 主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和 PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。 ? 它主要適用于蛋白質(zhì)顯色 、 完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析 。 ? 結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明 。 ? 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 ? 胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（ PVDF）和 /或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。 55 聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測 理想顯色劑的 7S ? 安全 （ safety） ： ? 靈敏 （ sensitivity） ： ? 簡單 （ simplicity） ： ? 特異性 （ specificity） ： ? 快速 （ speed） ： ? 穩(wěn)定 （ stability） ： ? 兼容性 （ synergy） ： 56 有機(jī)染料和銀染 ? 考染靈敏度為 30~100ng，線性范圍是 20倍；銀染的線性范圍是 40倍，靈敏度是考染的 100倍。 54 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類似。 ? 建議方案是：用含 2%(m/v)SDS、 1%(m/v)DTT、6mM尿素和 30%甘油的 50mM Tris（ ）緩沖液先平衡 15min，再用 5%(m/v)碘乙酰胺取代 DTT后的上述緩沖液平衡 15min。 保存數(shù)月。 ? 最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗(yàn)來確定。 ? 聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 ? IPG膠條的 pH范圍： 48 IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l 49 IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗(yàn)確定。 ? 待研究蛋白的豐度： ? 樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。 ? 不同的加樣方法和加樣
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