雙向電泳技術(shù)ppt課件-wenkub.com
2025-05-09 06:43 本頁面
【正文】 ? 其中 SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料 。 ? 這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過 SAGE所獲得的基因表達水平的動態(tài)范圍相匹配 。 59 有機熒光團染料 ? 包括共價結(jié)合和非共價結(jié)合的熒光團染料兩類 。 ? 該技術(shù)主要包括金屬鹽染料 、 鋅－咪唑染料等的使用 。 57 負(fù) 染 ? 能專門提高 PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 ， 但不能用于膜上染色 。 ? 膠體考馬斯亮藍染色技術(shù)可實現(xiàn) PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為 8~10ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 52 IEF的基本條件 Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total total Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 53 兩維間的平衡 ? 一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－ 80176。 50 預(yù)分步收集 細(xì)胞漿 細(xì)胞核 細(xì)胞膜 核糖體及其他特定細(xì)胞成份 細(xì)胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì) 3倍 3倍 亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖 51 聚焦時間的優(yōu)化 ? 理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時間是 IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。 ? 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成 pH梯度。 ? 非變性 /還原 /SDS2DPAGE：非變性條件下 IEF聚焦 ， 之后用 8M尿素＋5%β ME＋ 2%SDS進行平衡 ， 再進行第二 向 SDSPAG電泳 。 35 連續(xù)電泳 不連續(xù)電泳 濃縮效應(yīng) 凝膠層 緩沖液離子成分 pH 電位梯度 濃縮效應(yīng) 電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 36 影響凝膠聚合的因素 ① 形成凝膠試劑的純度 ② 凝膠濃度 ③ 溫度和氧氣的影響： 2325℃ 聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點 37 二、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 基本原理 ① 聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉 (sodium dodecylsulphate)SDS，蛋白電泳遷移率取決于其分子量，而與形狀及所帶電荷無關(guān)。 固相 pH梯度可窄至 ，因此分辨率極高，可達 ； pH梯度穩(wěn)定，不漂移；靈活性大，可隨意選擇 pH梯度和斜率；重復(fù)性好；加樣容量大；樣品中鹽的干擾??；對堿性蛋白質(zhì)也能很好的分離，無邊緣效應(yīng)，故可用很窄的膠條（如 5mm寬）聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相，但固相 pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠，電泳時候需要高電壓，電泳時間長，窄范圍 pH測定困難，只能計算。所以它是固相的，即使是在電場中也不會漂移。 29 固相 pH梯度的建立 固相 pH梯度等電聚焦技術(shù)的突破要歸功于 Immobilines試劑（ Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基礎(chǔ)上開發(fā)的固相 pH梯度（ IPG）技術(shù)。添加表面活性劑。 載體兩性電解質(zhì)的缺點 ① 載體兩性電解質(zhì)合成過程復(fù)雜，影響蛋白質(zhì)點的位置，從而影響了重復(fù)性； ② 負(fù)極漂移現(xiàn)象，使 pH梯度不穩(wěn)定； ③ 負(fù)極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無法聚焦； ④ 凝膠灌制重復(fù)性差，凝膠機械穩(wěn)定性差，影響重復(fù)性。人工 pH梯度。 ④ 化學(xué)組成不同于被分離物質(zhì)，不干擾測定。 組成每一種蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸的數(shù)目和比例是不同的，故蛋白質(zhì)的等電點范圍很寬，這使得可以利用它來分離和分析蛋白質(zhì)。 21 利用蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子等電點的不同，在一個 穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的（或非線性） pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。 ，當(dāng)通直流電時，兩性電解質(zhì)載體即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1