雙向電泳技術ppt課件(已修改)
2025-05-24 06:43 本頁面
【正文】 1 第三章 雙向電泳技術 2 *1809年俄國物理學家 Peй ce首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。 *1909年 Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。 他用不同 pH的溶液在 U形管中測定了轉化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。 *1937年瑞典 Uppsala大學的 Tiselius對電泳儀器作了改進，創(chuàng)造了 Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質(zhì)的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及 α 、 β 、 γ 球蛋白組成的，由于 Tiselius在電泳技術方面作出的開拓性貢獻而獲得了 1948年的諾貝爾化學獎。 *1948年 Wieland和 Fischer重新發(fā)展了以濾紙作為支持介質(zhì)的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。 *從上世紀 50年代起，特別是 1950年 Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質(zhì)的分離以后，開創(chuàng)了利用各種固體物質(zhì)（如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等）作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳方法。 *1959年 Raymond和 Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)，創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術的分辨率，開創(chuàng)了近代電泳的新時代。 *由 80年代發(fā)展起來的新的毛細管電泳技術，是化學和生化分析鑒定技術的重要新發(fā)展，己受到人們的充分重視。 *雙向電泳由 O’Farrell’s于 1975年首次建立并成功地分離約 1000個 蛋白。 3 一、電泳的基本原理 在電場作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的方向移動的現(xiàn)象稱為電泳（ electrophoresis)。 由 F = Eq， f = 6π r υ η 可得 υ =Eq/(6π r η ) 帶電顆粒的泳動速度同 電場強度 和分子本身所帶的 凈電荷量 成 正比 ，與 顆粒半徑 和 介質(zhì)黏度 成 反比 。 蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)。其泳動速度取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量以及顆粒的大小和形狀。 第一節(jié) 蛋白質(zhì)電泳的基本原理 4 在一定 pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷 (種類和數(shù)量 )、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本原理。 5 二、影響電泳速度的因素 電場強度； 緩沖溶液的 pH； 緩沖溶液的離子強度； 電滲； 焦耳熱 三、電泳的分類 按原理分類： 自由界面電泳 ：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。 穩(wěn)態(tài)電泳 （或稱置換電泳）：分子顆粒的電泳遷移在一定時間達到一個穩(wěn)態(tài)后，帶的寬度不隨時間而變化。 區(qū)帶電泳 ：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術上的差異，又可分為不同的類型。 6 7 ??? 按 支持介質(zhì)種類 的不同，區(qū)帶電泳可分為 ① 紙電泳 ：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 ??? 以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。 8 ③ 淀粉凝膠電泳 ：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復的電泳結果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。 ④ 瓊脂糖凝膠電泳 ：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應。 ⑤ 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。 ? 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)。 9 ?? 另外根據(jù)支持介質(zhì)形狀不同 ， 區(qū)帶電泳可分為 ：薄層電泳 、 板電泳 、 柱電泳 。 ?? 根據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、定量電泳、免疫電泳。 按 pH的連續(xù)性不同，可分為：連續(xù) pH電泳，不連續(xù) pH電泳。 10 四、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ polyacrylamidegel electrophoresis，簡稱 PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。 PAGE應用廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定分子量、等電點等。 11 丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點： ①幾乎無電滲作用。 ②化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應。對 pH和溫度變化較穩(wěn)定。 ?在一定濃度范圍內(nèi)凝膠無色透明，有彈性，機械性能好，易觀察。 ?凝膠孔徑可調(diào)。 ?分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而有更高的分辨率。 12 聚丙烯酰胺凝膠的聚合 13 催化劑和加速劑的種類 ① APTEMED：化學聚合作用。 加速劑四甲基乙二胺 (TEMED)的堿基可使
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