雙向電泳技術(shù)ppt課件(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-06-12 06:43:05 本頁(yè)面
【正文】 泳技術(shù)當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)： 低拷貝蛋白的檢測(cè)受限； 極酸或極堿蛋白的分離較難； 分子質(zhì)量極大或極小蛋白的分離較難； 難溶蛋白的檢測(cè)較困難； 得到高質(zhì)量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術(shù) 45 一維固相 pH梯度等電聚焦（ IEF with IPG）： ? IPG膠的材料是 Immobilines，為擁有CH2=CHCONHR結(jié)構(gòu)的 8種丙烯酰胺衍生物系列，其中 R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在 pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的 IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過(guò)乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成 pH梯度。通過(guò)這種方式生成的 IPG不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的 IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。 46 IPG膠條的重泡脹 ? 泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入 IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來(lái)的 IEF。 ? 不同的加樣方法和加樣量會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的差異： ? Protean IEF cell、 IPGphor等集成設(shè)備的使用： ? 20mmol/L DTT 墊片的使用： ? 溫度的選擇： 47 蛋白載樣量 影響 IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的因素包括： ? 待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。 ? 電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無(wú)需考慮太多其它因素。 ? 待研究蛋白的豐度： ? 樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。 ? IPG膠條的 pH范圍： 48 IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l 49 IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長(zhǎng)，預(yù)試驗(yàn)確定。 50 預(yù)分步收集 細(xì)胞漿 細(xì)胞核 細(xì)胞膜 核糖體及其他特定細(xì)胞成份 細(xì)胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì) 3倍 3倍 亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖 51 聚焦時(shí)間的優(yōu)化 ? 理論上講，要獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需最佳時(shí)間是 IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。 ? 聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 ? 過(guò)度聚焦雖然不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會(huì)因?yàn)榛钚运D(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過(guò)多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 ? 最佳時(shí)間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長(zhǎng)度通過(guò)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。 52 IEF的基本條件 Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 total total Stemp 1 Stemp 2 Stemp 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid 53 兩維間的平衡 ? 一維結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－ 80176。 保存數(shù)月。 ? 但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而在 SDSPAGE時(shí)電泳能順利進(jìn)行。 ? 建議方案是：用含 2%(m/v)SDS、 1%(m/v)DTT、6mM尿素和 30%甘油的 50mM Tris（ ）緩沖液先平衡 15min，再用 5%(m/v)碘乙酰胺取代 DTT后的上述緩沖液平衡 15min。如果用 TBP代替 DTT則只需一步平衡。 54 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類似。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無(wú)需濃
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