雙向電泳技術(shù)ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-12 06:43本頁(yè)面
【正文】 縮膠，因?yàn)樵?IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性 IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。 55 聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測(cè) 理想顯色劑的 7S ? 安全 （ safety） ： ? 靈敏 （ sensitivity） ： ? 簡(jiǎn)單 （ simplicity） ： ? 特異性 （ specificity） ： ? 快速 （ speed） ： ? 穩(wěn)定 （ stability） ： ? 兼容性 （ synergy） ： 56 有機(jī)染料和銀染 ? 考染靈敏度為 30~100ng，線性范圍是 20倍；銀染的線性范圍是 40倍，靈敏度是考染的 100倍。 ? 膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn) PAGE的無(wú)背景染色，其極限靈敏度為 8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。 ? 胺基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（ PVDF）和 /或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。 ? 銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。 ? 這兩種染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。 57 負(fù) 染 ? 能專門(mén)提高 PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率 ， 但不能用于膜上染色 。 ? 結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明 。 ? 速度快 （ 5~15min） ， 蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如 EDTA或 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì) 。 ? 它主要適用于蛋白質(zhì)顯色 、 完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析 。 ? 該技術(shù)主要包括金屬鹽染料 、 鋅－咪唑染料等的使用 。 58 膠體擴(kuò)散染料 ? 主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和 PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。 ? 最好的膠體金染色的靈敏度與 PAGE膠內(nèi)的銀染類似。 ? 這種技術(shù)主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等。 59 有機(jī)熒光團(tuán)染料 ? 包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類 。 后者最為常用 ， 其典型代表是已經(jīng)商品化的 SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 。 ? 這三種染料可對(duì) SDSPAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色 ，約 30~60min完成 ， 靈敏度為 2~10ng。 染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室 300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存 ， 其線性范圍為 3個(gè)數(shù)量級(jí) 。 ? 這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過(guò) SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配 。 ? 在 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后 ， 蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或 Edman測(cè)序來(lái)鑒定蛋白質(zhì) 。 60 金屬螯合染料 ? 這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的 、 相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑 ， 其設(shè)計(jì)專門(mén)與常用微量化學(xué)表征過(guò)程兼容 。 它們不包含戊二醛 、 甲醛或Tween20等 ， 很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（ 包括自動(dòng)化凝膠染色儀 、 圖像分析工作站 、 機(jī)器人剪切儀器 、 蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等 ） 相結(jié)合 。 ? 其中 SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料 。 61 第五節(jié) 電泳過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題及解決辦法 一、第一向等電聚焦的問(wèn)題 ① 固相 pH梯度膠條在靠近電極附近燒焦 ② 電壓太低，達(dá)不到最高電壓 ③ 電流為零或很低 ④ 脲在膠條表面結(jié)晶 62 二、第二向 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的問(wèn)題 ① 開(kāi)始時(shí)沒(méi)有電流，電泳太慢 ② 溴酚藍(lán)前沿不規(guī)則 三、染色的問(wèn)題 ① 水平條紋 ② 垂直條紋 ③ 點(diǎn)紋理 63 凝膠的圖像處理分析和 典型流程 ? 凝膠圖像的掃描： ? 圖像加工： ? 斑點(diǎn)檢測(cè)和定量： ? 凝膠配比： ? 數(shù)據(jù)分析： ? 數(shù)據(jù)呈遞和解釋： ? 2DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立： 64 蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切 包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過(guò)程 65 質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程 樣品制備 與 IPG膠條水化 IPG電泳 與上樣緩沖液浸潤(rùn) SDSPAGE 轉(zhuǎn) PVDF膜 膠內(nèi)直接染色 染色 取出蛋白點(diǎn) 胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上 MALDIMS肽指紋圖 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 蛋白質(zhì)鑒定 已知 反向 HPLC分離 MALDIMS，PSD片段分析 示知 ESIMSMS、微測(cè)序 66 實(shí)驗(yàn)方法 完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)） 肽混合物 質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量 （ MALDIMS,ESIMS) 選擇肽段裂解 PSDMALDIMS,ESIMS/MS) 計(jì)算方法 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)） 肽質(zhì)量檢索： 片 未解析碎片離子檢索：片 酶切 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略 67 體外 pmol [32P]蛋白質(zhì)標(biāo)記 蛋白質(zhì)分離 蛋白酶切 2D磷酸化做圖 ?LCESIMS或 MALDIMS ?LCESIMS ?HPLC IMAC 磷酸化氨基酸分析 體內(nèi) [32P]細(xì)胞標(biāo)記 蛋白酶切 2D磷酸化做圖 相關(guān)分析 磷酸化位點(diǎn)分析策略
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