凝膠電泳ppt課件(2)(已修改)
2025-05-14 12:02 本頁面
【正文】 第二節(jié) 基因操作的主要技術(shù)原理 ?凝膠電泳 ?擴(kuò)增原理 ?分子雜交 ?DNA測(cè)序 ?生物芯片 一、凝膠電泳 ? 它是一種分析鑒定重組 DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同時(shí)也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。 ?瓊脂糖凝膠電泳 ?聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 基本原理 ? 帶有負(fù)電荷的 DNA或 RNA核苷酸鏈，依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液， 在電場(chǎng)中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極 。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。 DNA的遷移速率決定因素 ? 1 DNA分子的大小 雙鏈 DNA分子遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)近似成反比； ? 2 瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快； ? 3 DNA的構(gòu)象 一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。 ? 4 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 溴化乙錠（ EB）插入雙鏈 DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。 ? 5 所用的電壓 低電壓時(shí) DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。 ? 6 瓊脂糖種類 常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖； ?凝膠電泳的分辨力： ? 與凝膠的類型和密度相關(guān) ? 瓊脂糖凝膠的分辨力在 ～ 50Kb之間 。 ? 聚丙烯酰胺的分辨力在 1～ 1000bp之間 Separation Range Vs. % Agarose Low Geling Agarose 46 不同類型瓊脂糖的性質(zhì) 瓊脂糖類型 凝結(jié)溫度 /℃ 熔化溫度 / ℃ 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖 35~38 90~95 不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異 40~42 85~90 高強(qiáng)度瓊脂糖 34~43 85~95 修飾的低熔點(diǎn) / 凝點(diǎn)瓊脂糖 25~35 63~65 35 65 超低熔點(diǎn) 8~15 40~45 低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖 25~30 70 38 85 30 75 ?Agarose Gel Electrophoresis ? 瓊脂糖（ agarose）是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。 ?半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。 D半乳糖 3， 6脫水 L半乳糖 瓊脂糖凝膠的特點(diǎn) （ 一 ） 優(yōu)點(diǎn) ， 幾乎消除了瓊脂的電滲 ， 故無拖尾現(xiàn)象 。 ， 孔徑較大 ， 可用來分離酶的復(fù)合物 、 核酸 、 病毒等大分子物質(zhì) 。 ， 可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色 。 ， 可直接利用紫外光吸收法作定量測(cè)定 （ 二 ） 缺點(diǎn) ， 易破碎 ， 濃度不能太低 。 ， 不易保存 ， 臨用前配制 。 ， 電泳后必須立即固定染色 。 PAGE相比 ， 分子篩作用小 ， 區(qū)帶少 。 ?分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（ LMP）瓊脂糖。 ?（ 1） LMP瓊脂糖 ? 熔點(diǎn)： 62～ 65℃ ? 熔解后，在 37℃ 可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)；在 25℃ 可保持液態(tài)約 10min ?回收 DNA操作：將凝膠在 65℃ 下加熱數(shù)分鐘，再向液態(tài)瓊脂糖中加入過量酚液抽提 DNA，經(jīng)離心獲得含 DNA分子的上清液，酶切 DNA片段后電泳。 （ 2）瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)： ? 緩沖液： 1 TAE（ TBE TPE） ? 凝膠的含量：根據(jù)檢測(cè)的 DNA大小 ? 加 DNA樣品： 1μg，指示劑 溴酚藍(lán) ? 電泳條件：大片斷低電壓長(zhǎng)時(shí)間，小片段高電壓短時(shí)間 (5V/cm) （ 2）瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)： ?染色和觀察：溴化乙錠（ ethidium bromide， EB）染色，在 300nm波長(zhǎng)的紫外下觀察（凝膠成像儀）， 能看到 μg的微量 DNA ?DNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比 操作 預(yù)染色的標(biāo)本 用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn) DNA對(duì) DNA片斷大小的估算 Sample Well 25 ng 1 kb ladder % Agarose 1 2 4 6 8 10 12 kb Agarose Gel Electrophoresis EtBr Detection Limit: ~510 ng DNA Agarose gel electrophoresis Agarose gel electrophoresis 【 注意事項(xiàng) 】 ? 1. 瓊脂糖融化時(shí)，檔位不宜太高。 2. 制膠和加樣過程中要防止氣泡的產(chǎn)生。 3. EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌。必須戴手套操作，嚴(yán)格注意防護(hù)。 4. 加樣時(shí)， Tip頭不宜插入樣品孔太深，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或 DNA帶型不整齊。 5. 電源接通時(shí)，應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確。 6. 電泳儀有電壓顯示，并不一定標(biāo)志電泳槽已接通，應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況。負(fù)極的氣泡比正極多一倍，表示電泳已開始。 DNA分子的雙鏈中，在紫外光的照射下，插入溴化乙錠的 DNA呈橙紅色熒光，所以溴化乙錠可以作為熒光指示劑指示 DNA含量和位置。 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ?Polyacrylamide Gel Electrophoresis ， PAGE 原理 ? 聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺 (acrylamide，簡(jiǎn)稱 Acr)和交聯(lián)劑 N,N甲叉雙丙烯酰胺 (N,Nmethylenebisacylamide，簡(jiǎn)稱 Bis)在加速劑 N， N，N?， N?— 四甲基乙二胺 (N， N
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1