電泳技術(shù)及其在分子生物學(xué)中的應(yīng)用-wenkub.com
2025-01-13 19:44 本頁面
【正文】 倒掉二抗溶液，用 PBST (或 TBST)漂洗液濾膜 3次，每次 10min。 1）蛋白提取 2） SDSPAGE 3）轉(zhuǎn)膜 4）封閉 5）一抗作用 6）標(biāo)記二抗作用 7）結(jié)果檢測(cè) Western blotting 基本步驟： 轉(zhuǎn)膜 將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間。 TwoDimensional SDSPAGE PI (by isoelectric focusing – IEF) Approximate mol wt. (by SDS PAGE) Example of 2DGel Separation of Proteins 2D gels are ideal tools of protein separation because of their high resolution (1000 spots are monly visualized on a single gel) and visual readout Western blotting 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。 因此 ， 蛋白質(zhì) SDS復(fù)合物在 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響 ， 而主要取決于橢圓棒的長軸長度 ， 即蛋白質(zhì)亞基分子量的大小 。這樣，在同種生物的不同個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)不同長度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性 (Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP)。一四甲基乙二胺 )和 過硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑， N， N39。當(dāng)凝膠濃度太高時(shí)，凝膠孔徑變小，環(huán)狀 DNA（球形）不能進(jìn)入膠中，相對(duì)遷移率為 0，而同等大小的直線 DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對(duì)遷移率大于 0。 可用于檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸（ DNA和 RNA）。 因此，為了獲得電泳分離 DNA片段的最大分辨率，所用電壓不宜高于 5V/cm。 緩沖液系統(tǒng) 常用的電泳緩沖液有 EDTA（ ）和 Tris乙酸（ TAE）， Tris硼酸（ TBE）或 Tris
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