分子生物學的基本操作-wenkub.com
2025-01-10 07:57 本頁面
【正文】 因此，如果載體分子和待克隆的 DNA分子都是用同一對限制性核酸內(nèi)切酶切割，那么，載體分子和外源 DNA片段將按一種取向退火形成重組 DNA分子，從而保證外源 DNA片段定向插入載體分子?；?，所編碼的 α肽鏈可參與 α互補作用。端的一段多克隆位點（ MCS） 區(qū)段，它并不破壞該基因的功能。 第三個優(yōu)點：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可累積 1000~3000個拷貝，為重組體 DNA的 制備提供了極大的方便。 pBR322質(zhì)粒載體 pBR322質(zhì)粒是由三個不同來源的部分組成的： 第一部分來源于 pSF2124質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ ampr）； 第二部分來源于 pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（ tetr）； 第三部分則來源于 ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的 DNA復制起點（ ori）。 . ColE1質(zhì)粒載體 ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復制控制的多拷貝質(zhì)粒。 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 . pSC101質(zhì)粒載體 pSC101是一種嚴緊型復制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細胞僅有 1～ 2個拷貝。質(zhì)粒 DNA的氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補鏈不會完全分離，當 pH恢復至中性時，變性的質(zhì)粒 DNA又恢復到原來的構(gòu)型保存在溶液中。 質(zhì)粒 DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。 2. 至少應有一個克隆位點，以供外源 DNA插入。 大分子量的 DNA 移動的慢 小分子量的 DNA 移動的快 電泳緩沖液 陽極 陰極 DNA加樣孔 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 ~50kb之間 稱樣 溶解 加熱 制板 倒膠 電泳操作基本程序 取樣 點樣 電泳 檢測 結(jié)果 檢測 :溴化乙錠（ ethidium bromide， 簡稱 EtBr） 染色，紫外觀察。 電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的 遷移率 ，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與分子同介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 PCR Cycle Step 1 Denaturation Template DNA by Heat (95oC) Target Sequence Target Sequence PCR原理示意圖 ①模板 DNA的變性：模板 DNA經(jīng)加熱至 93℃ 左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備； PCR Cycle Step 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences ②模板 DNA與引物的退火 (復性 )：模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； PCR Cycle Step 3 At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as plementary nucleotides are incorporated ③引物的延伸：DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的互補 鏈。 5. 將目的基因克隆到 表達載體 上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關系。 General process of gene engineering 1. 從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的 DNA片段。 因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復。 所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的 DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過程。 1973 Boyer, Cohen amp。 分子克隆的載體 具備自主復制能力的 DNA分子（ vector）， 如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復制子都可以作為基因?qū)氲?
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