【正文】 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 83 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 84 EMSA還用于研究與蛋白質(zhì)相結(jié)合的 DNA序列的特異性。 MiRNA：在細胞核中轉(zhuǎn)錄的較大的 primiRNA經(jīng)由Drosha(一種 RNAse Ⅲ 酶 ) 加工成為單鏈 premiRNA；接著，發(fā)夾狀、部分互補的 premiRNA在細胞質(zhì)中被 Dicer*（一種 RNAse Ⅲ 酶）酶切割形成 miRNA；在生物體中的表達具有時序性、保守性和組織特異性。 MiRNA表達的時序性和組織特異性暗示 miRNA的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。成熟的 miRNA， 5′端有一個磷酸基團， 3′端為羥基。OH基團，且 339。 雙鏈小分子 RNA可高效、特異性降解細胞內(nèi)同源 mRNA，阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型，這種現(xiàn)象稱為 RNA干擾 (RNAi)。同時， Nature雜志亦將 Small RNA評為年度重大科技成功之一。 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究 熒光共振能量轉(zhuǎn)移法 (FRET) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 68 用 CFP吸收波長 440nm作為激發(fā)波長，實驗靈巧設(shè)計，使當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)a與 b沒有發(fā)生相互作用時， CFP與 YFP相距很遠不能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因而檢測到的是 CFP的發(fā)射波長為 480nm的熒光。 ? 將 AD的 DNA與待篩選的 cDNA文庫中不同插入片段相連接，獲得 “ 獵物 ” 載體，轉(zhuǎn)化含有 “ 誘餌 ” 的酵母細胞。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 57 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 58 酵母雙雜交系統(tǒng) (Yeast twohybrid system) 原理： ? 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨立的結(jié)構(gòu)域組成的，即由 DNA結(jié)合域 (BD)和轉(zhuǎn)錄激活域 (AD)構(gòu)成。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 54 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 55 酵母單雜交系統(tǒng) (yeast onehybrid system) 是二十世紀 90年代中期發(fā)展起來的技術(shù)，常用于研究DNA蛋白質(zhì)之間的相互作用。 ? 使用該完整序列的兩端引物進行第二輪 PCR擴增。由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號， 省去 了 繁瑣的免疫熒光 反應(yīng) ，不再需要購買熒光抗體，也由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進和提高，直接標(biāo)記的熒光探針越來越成為首選，其熒光強度和信號大小都 易于 在普通熒光顯微鏡下 觀察 ，操作過程中也 不需 要嚴格 避光 ，使 FISH過程變得簡便而易于操作。 ? FISH技術(shù)不需要放射性同位素，實驗周期短，檢測靈敏度高。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 40 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 41 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 42 原位雜交技術(shù) (in situ hybridization, ISH) 是用標(biāo)記的 核酸探針 ，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對 核酸 進行 定位 或 相對定量 研究的一種手段。 Long SAGE； Short SAGE。 肽段分離。 SDS聚丙烯酰胺：分子質(zhì)量 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 24 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 25 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 26 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 27 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 28 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 29 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 30 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 31 生物學(xué)問題的提出 實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計 實驗組和對照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點的切取 胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對 新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn) 其它實驗的進一步驗證（ western blot等）