【正文】 通過設(shè)計一系列引入一個或數(shù)個突變堿基的放射性標(biāo)記探針，運(yùn)用 EMSA來評估這些突變對探針 DNA與結(jié)合蛋白相互作用的影響，進(jìn)而確定該探針 DNA分子中與蛋白質(zhì)直接發(fā)生相互作用的關(guān)鍵性堿基。 如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合 ， 那么由于分子量增大 ，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯 ， 在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應(yīng)縮短了 ， 所以當(dāng)某個DNA片段與細(xì)胞提取物混合之后 ， 如果它在凝膠電泳中的移動距離變小了 ， 就說明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合 。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 81 功能階段 miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用；而 siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 82 凝膠阻滯實驗 (electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 是體外分析 DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù) 。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 80 成熟過程 SiRNA：直接來源是長鏈的 dsRNA（通常為外源）；經(jīng)過 Dicer酶 *切割形成雙鏈 siRNA,而且每個前體dsRNA能夠被切割成不定數(shù)量的 siRNA片段。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 78 相同點： MiRNA和 siRNA都是由 22個左右的核苷組成； 它們都是 Dicer酶的產(chǎn)物； 它們都會和 RISC復(fù)合體結(jié)合； 它們都可以抑制靶標(biāo)基因的翻譯； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 79 兩者之間的主要差異： 起源階段 SiRNA：通常是外源的，如病毒感染和人工插入的 dsRNA被剪切后產(chǎn)生外源基因進(jìn)入細(xì)胞（注：病毒入侵，或者是自身合成 RNA中出現(xiàn)錯誤，細(xì)胞內(nèi)就會產(chǎn)生雙鏈 RNA，來阻止這些異?；虻谋磉_(dá)）。 擬南芥中的 miR171僅在其花序中高水平表達(dá)，在某些組織低水平表達(dá)，在莖、葉等組織中卻無任何表達(dá)的跡象； 2024h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn) miR12，卻找不到 miR3miR6，在成年果蠅中表達(dá)的 miR1和 let7也無法在果蠅胚胎中表達(dá)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 74 編碼 miRNAs的基因最初產(chǎn)生一個長的 priRNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約 7090個堿基大小、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈 RNA前體（ premiRNA）并經(jīng)過 Dicer酶加工后生成。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ ORF）。端有兩個突出的堿基。P、339。 這些雙鏈小 RNA稱 siRNA(Small/short interfering RNA, siRNA)。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 70 RNAi(RNA interference, RNA)技術(shù) RNA干擾廣泛存在于植物、真菌、線蟲、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴乃至人類的幾乎所有真核生物中，大腸桿菌中也存在 RNA干擾現(xiàn)象。 2022年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。 RNAi”評為 2022年度最耀眼的明星。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) a與 b發(fā)生相互作用時，由于蛋白質(zhì) b受蛋白質(zhì) a作用而發(fā)生構(gòu)象變化，使 CFP與 YFP充分靠近發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，此時檢測到的就是 YFP的發(fā)射波長為 527nm的熒光。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 61 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 62 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 63 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 64 Far western體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 65 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 66 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 67 CFP(青色熒光蛋白 )的發(fā)射光譜與 YFP(黃色熒光蛋白 )的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B，當(dāng)它們足夠接近時，用 CFP的吸收波長激發(fā)， CFP的發(fā)色基團(tuán)將會把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至 YFP的發(fā)色基團(tuán)上，引起 CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失，主要發(fā)射將是 YFP的熒光。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 60 實驗方法： ? 一旦酵母細(xì)胞中表達(dá)的 “ 誘餌 ” 蛋白與 “ 獵物 ” 載體中表達(dá)的某個蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AD和 BD結(jié)構(gòu)域就會被牽引靠攏，激活報告基因表達(dá)。 ? 導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，使之表達(dá)帶有 BD的融合蛋白，與報告基因上游的啟動調(diào)控區(qū)相結(jié)合，準(zhǔn)備作為 “ 誘餌 ” 捕獲與已知蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。 ? 單獨(dú)的 BD能與特定基因地啟動區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄，而由不同轉(zhuǎn)錄因子的 BD和 AD所形成的融合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 56 將已知的特定順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子(minimal promoter, Pmin)上游，把報告基因連接到Pmin下游，然后將編碼待檢測轉(zhuǎn)錄因子 cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激