揚(yáng)州大學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)5-分子生物學(xué)研究方法(參考版)
2025-01-06 05:44本頁面
【正文】 基因克隆技術(shù)簡介 基因表達(dá)研究技術(shù) 基因表達(dá)系列分析技術(shù) RNA選擇性剪切機(jī)制 原位雜交技術(shù) 定點(diǎn)突變技術(shù) RNAi技術(shù) P171180 ? 蛋白質(zhì)組學(xué) ：蛋白質(zhì)和基因組研究相結(jié)合，研究某一物種、個體、器官、組織、或細(xì)胞在特定條件、特定時間所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)圖譜。 基因克隆技術(shù)簡介 基因克隆技術(shù)簡介 ? 主要實(shí)驗(yàn)過程： a. 選擇缺失 GAL4編碼基因的酵母寄主菌株 b. 研究的獵物 (或稱靶蛋白 )蛋白的基因與編碼 AD的序列結(jié)合 (bait)蛋白的基因與編碼 BD的序列結(jié)合 ,形成兩段融合基因 d. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于選擇培養(yǎng)基上，篩選表達(dá)相互作用的雜種蛋白（激活報告基因轉(zhuǎn)錄）的陽性菌落。 ?細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 RACE，擴(kuò)增 5未知序列 3′RACE 擴(kuò)增 3′未知序列 5 ′ 已知的接頭序列； 基因特異反向序列 3 ′ 寡聚 dT下游序列； 基因特異反向序列 基因克隆技術(shù)簡介 cDNA差示分析法 (cDNARDA法 ) ? 差減雜交與 RTPCR方法相結(jié)合，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換 cDNA兩端接頭等方法，特異擴(kuò)增目的基因片段 基因克隆技術(shù)簡介 基因克隆技術(shù)簡介 主要步驟是： mRNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，用 4 堿基識別酶消化，與接頭 1連接，PCR 擴(kuò)增；去除接頭 1，擴(kuò)增子接上接頭 2，與驅(qū)逐子雜交，PCR擴(kuò)增；去除接頭2，加上接頭 3，再與 driver雜交，再擴(kuò)增，篩選出目的片段、克隆、測序。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用同源片段替代靶基因片段，進(jìn)行精確的定位修飾和基因改造，同染色體一起穩(wěn)定遺傳 二、常見的 DNA操作技術(shù) ? 完全基因敲除 ? 條件型基因敲除 ? 植物基因敲除株系篩選（ TDNA插入失活） 常見的 DNA操作技術(shù) 基因克隆技術(shù)簡介 RACE(rapid amplification of cDNA ends) 一種通過 PCR進(jìn)行 cDNA末端快速克隆的技術(shù)，是以 mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成 cDNA第一鏈后用 PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個特異位點(diǎn)到 3′ 或 5 ′ 端之間未知序列的方法。 常見的 DNA操作技術(shù) 構(gòu)建步驟： ? 高質(zhì)量 mRNA制備：純化試劑盒，生物素 P156 ? 反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA: 反轉(zhuǎn)錄酶， olig(dt) ,R6 ? 與噬菌體載體分子連接 ? 噬菌體的包裝 常見的 DNA操作技術(shù) 常見的 DNA操作技術(shù) m R N A逆 轉(zhuǎn) 錄 酶c D N A復(fù) 制雙 鏈 cDNA載 體重 組DNA分 子受 體 菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 常見的 DNA操作技術(shù) 文庫中篩選目的基因 DNA探針 ：帶有特殊堿基序列的單鏈 DNA或RNA分子 ,可以用放射性物質(zhì)或免疫性物質(zhì)標(biāo)記 ,通過雜交 ,DNA探針 常用于檢測互補(bǔ)的堿基序列。 常見的 DNA操作技術(shù) cDNA文庫 ? cDNA文庫 (plementary DNA library)以組織細(xì)胞中的 mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA ，各 cDNA分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。 上述三個步驟為一個循環(huán)，經(jīng) 2530次循 環(huán)后，可將模板 DNA擴(kuò)增達(dá)百萬倍。 ? 常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等 ? ?
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