揚(yáng)州大學(xué)現(xiàn)代分子生物學(xué)5-分子生物學(xué)研究方法-在線瀏覽
2025-02-05 05:44本頁(yè)面
【正文】 這對(duì)醫(yī)學(xué)上各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。 命名 Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 即反相重復(fù)結(jié)構(gòu)，是 DNA分子中以某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對(duì)稱的序列。 ? T4175。DNA連接酶 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 目的基因的來(lái)源 ? 原核細(xì)胞 ? 真核細(xì)胞： cDNA或 gDNA文庫(kù) ? 人工合成及 PCR擴(kuò)增目的基因 天然 DNA （染色體 DNA、病毒DNA(噬菌體 DNA)、質(zhì)粒 DNA、線粒體DNA和葉綠體 DNA） 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 （八）重組實(shí)驗(yàn)中的主要載體 定義： 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體 。 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 ? 噬菌體載體： 雙鏈 DNA病毒，約 50kb,兩端有一個(gè) 12個(gè)核苷酸 5′端突出粘性末端 λ噬菌體 ? 黏粒、 YAC、 BAC ： 高容量載體 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 個(gè)克隆載體所容納的外原 DNA片段的大小 ? 質(zhì)粒： 10kb ? λ噬菌體： 23kb ? 黏粒： 45kb ? BAC： 350kb ? YAC： 1000kb 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 常見的 DNA操作技術(shù) 轉(zhuǎn)化 （ transformation） ： P151 感受態(tài)細(xì)胞（ Competent cells） ： 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法（如： CaCl2等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許有外源 DNA的載體分子通過，處于這種狀態(tài)下的細(xì)胞稱 ~ 將異源 DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀 轉(zhuǎn)導(dǎo)？ 轉(zhuǎn)染？ 常用的轉(zhuǎn)化方法： ? 化學(xué)轉(zhuǎn)化（ CaCl2）法 ? 電擊法 常見的 DNA操作技術(shù) 化學(xué)轉(zhuǎn)化原理： 在 0℃ 冷凍處理時(shí)，處于 CaCl 2低滲溶液中的大腸桿 菌細(xì)胞膨脹成球形。在短暫的 熱沖擊下，細(xì)胞吸收外源 DNA ，然后在豐富培養(yǎng)基內(nèi) 復(fù)原并增殖，表達(dá)外源基因。 菌液：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期 場(chǎng)強(qiáng) (最大轉(zhuǎn)化效率 )： 溫度： 04℃ 常見的 DNA操作技術(shù) 克隆的篩選： ? 抗生素基因。將待擴(kuò)增的 DNA片段和兩側(cè)互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引物，經(jīng)過變性，退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá) 2n 倍 常見的 DNA操作技術(shù) 反應(yīng)體系 ? 模板 DNA： 待擴(kuò)增的目的片段 ? 特異性引物： 人工合成的與待擴(kuò)增的靶 DNA兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段， 1530bp ? DNA聚合酶 ? dNTP ? 含有 Mg2+的緩沖液 常見的 DNA操作技術(shù) PCR的基本反應(yīng)步驟： 1. 變性 ： 95℃ ，模板 DNA變性為單鏈； 2. 退火 ： 50℃ 左右，使引物與模板 DNA退火結(jié)合； 3. 延伸 ： 72℃ ， DNA聚合酶
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