分子生物學(xué)技術(shù)-在線瀏覽
2025-02-02 03:23本頁面
【正文】 、轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)和細(xì)胞骨架成份等的基因。 操縱基因（ operator): 指接受來自調(diào)節(jié)基因合成的調(diào)節(jié)蛋白的作用，使結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄活性得以抑制的特定的 DNA區(qū)段，也稱為控制單元。基因表達(dá)的此種嚴(yán)格調(diào)控機理，保證細(xì)胞不會浪費能量用于合成它所不需要的基因產(chǎn)物。即基因不但在結(jié)構(gòu)上是可分的，而且在功能上也是有分工的。 操縱子模型 二、核酸探測技術(shù) （一）指紋圖譜 （二）核酸分子雜交 （一）、指紋圖譜 指紋圖譜： 即核酸酶切圖譜，對生物的蛋白質(zhì)、 DNA和 RNA進行分析的電泳圖、雜交放射性自顯影圖等。 原理： 在微生物（細(xì)菌）細(xì)胞中有 1種限制性內(nèi)切酶類（ II， 稱為 RE）， 能特異性的識別和切割 DNA鏈上特定的一段 DNA片段，這類酶廣泛應(yīng)用于基因工程的各個方面。 方法： 酶切 、照相 核酸探針技術(shù) 前言 (一 ) 核酸探針的種類 (二 ) 核酸探針的制備 (三 ) 核酸雜交 (四 ) 核酸探針技術(shù)在動物檢疫中的應(yīng)用 前言 化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針 (probe)， 是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。 核酸探針技術(shù)原理是堿基配對。（基本過程是：加熱變性 降溫復(fù)性。每一種病原體都具有獨特的核酸片段，通過分離和標(biāo)記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。 作為診斷試劑，較常使用的是基因組 DNA探針和 cDNA探針。 將 RNA進行反轉(zhuǎn)錄，所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針序列也可克隆到質(zhì)粒或噬菌體中，以便大量制備。但由于來源極不方便，且 RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此應(yīng)用較少。放射性標(biāo)記探針用放射性同位素做為標(biāo)記物。常用的同位素有 32P、 3H、 35S。放射性標(biāo)記的優(yōu)點是靈敏度高，可以檢測到 Pg級；缺點是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不穩(wěn)定、成本高等。目前，許多實驗室都致力于發(fā)展非放射性標(biāo)記的探針。 二者都是半抗原。地高辛是一種類固醇半抗原分子，可利用其抗體進行免疫檢測，原理類似于生物素的檢測。 （二）核酸探針的制備 1. DNA探針制備 （ 1）以病原細(xì)胞核或病毒中提取的特異性DNA， 用理化學(xué)方法將其純化，然后再用限制性核酸酶將 DNA切割成若干片段，電泳回收目的 DNA； （ 2） 酶促反應(yīng)合成法，即從病原中提取mRNA， 在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補結(jié)構(gòu)的 DNA（ cDNA）； （ 3） 化學(xué)合成法，以單核苷酸為原料，人工合成 DNA的某一片段。 (三 ) 核酸雜交 雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相支持物常用硝酸纖維素膜 (nitrocellulose filter membrane， 簡稱 NC膜 )或尼龍膜 (nylon membrane)。前者包括三個基本過程：第一，通過印跡技術(shù)將核酸片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上；第二，用標(biāo)記探針與支持物上的核酸片段進行雜交；第三，雜交信號的檢測。某特點是靶分子固定在細(xì)胞中，細(xì)胞固定在載玻片上，以固定的細(xì)胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細(xì)胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細(xì)胞內(nèi)?？捎锰禺愋缘募?xì)菌、病毒的核酸做為探針對組織、細(xì)胞進行原位雜交，以確定有無該病原體的感染等。 近年來液相雜交技術(shù)有所發(fā)展。液相雜交步驟有所簡化，雜交速度有所提高，增加了特異性和敏感性，但與臨床診斷所要求的特異性和敏感性還有一定的距離。 (1) 斑點印跡 (Dotblot) 將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。 應(yīng)用斑點印跡技術(shù)，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，操作簡便、快速，在臨床診斷中應(yīng)用較廣。 (2) Southern印跡 (Southern blot) 這是指將 DNA片段經(jīng)瓊
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