分子生物學(xué)技術(shù)(文件)
【正文】 穩(wěn)定的復(fù)合物，通過(guò)連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì) (如酶、熒光素等 )進(jìn)行檢測(cè)。 2. RNA探針 全基因 RNA探針可用 RNA病毒的基因標(biāo)記即可；由 DNA轉(zhuǎn)錄出探針 RNA， 可由 RNA聚合酶獲得大量高純度的 RNA， 其靈敏度比 DNA探針高出 10多倍。 固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。例如。液相雜交與固相雜交的主要區(qū)別是不用純化或固定的靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。 為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點(diǎn)樣后的膜進(jìn)行 80℃ 真空烘烤 2h。常規(guī)處理如下，先用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì) DNA樣品進(jìn)行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將 得 DNA片段按分子量大小分離，接著對(duì)凝膠進(jìn)行變性處理，使雙鏈 DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到 NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各 DNA片段的相對(duì)位置保持不變。 Northern印跡的方法與 Southern印跡基本相同，可參照進(jìn)行。因此，在 Northern印跡前，須進(jìn)行 RNA變性電泳，在電泳過(guò)程中使 RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測(cè)核酸單鏈在一定溫 度和條件下進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)的過(guò)程。核酸探針可用以檢測(cè)任何特定病原微生物，并能鑒別密切相關(guān)的毒 (菌 )株和寄生蟲(chóng)。 三、 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction， PCR)由美國(guó)Centus公司的 Kary Mullis發(fā)明，于 1985年由Saiki等在 Science雜志上首次報(bào)道，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的體外快速擴(kuò)增 DNA的技術(shù)。模板 DNA變性、引物結(jié)合 (退火 )、引物延伸合成 DNA這三步構(gòu)成一個(gè) PCR循環(huán)。通過(guò)高溫變性、低溫退火和中溫延伸 3個(gè)溫度的循環(huán)，模板上介于兩個(gè)引物之間的片段不斷得到擴(kuò)增。除反轉(zhuǎn)錄 PCR外，尚有不對(duì)稱(chēng) PCR、 反向 PCR、 錨定 PCR、 多重 PCR、 著色互補(bǔ) PCR、 免疫 PCR和套式PCR等。 (2) 錨定 PCR(Anchored PCR) 通常進(jìn)行的PCR試驗(yàn)必須知道欲擴(kuò)增 DNA或 RNA片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR。方法是使含已知序列和未知序列的 DNA片段環(huán)化，再用限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī) PCR操作就可大量擴(kuò)增未知序列。 (2) 快速、準(zhǔn)確、安全檢測(cè)病原體 用 PCR技術(shù)不需經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和富集病原體，一個(gè) PCR反應(yīng)一般只需幾十分鐘至 2小時(shí)就可 完成。 PCR技術(shù)適用于檢測(cè)慢性感染、隱性感染，對(duì)于難于培養(yǎng)的病毒的檢測(cè)尤其適用。② 在反應(yīng)液中加入標(biāo)記的 dNTP， 經(jīng) PCR將標(biāo)記物摻入到新合成的 DNA鏈中，從而制得放射性和非放射性標(biāo)記探針。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。 PCR結(jié)合其它核酸分析技術(shù)，在精確區(qū)分病毒不同型、 不同株、不同分離物的相關(guān)性方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可從分子水平上區(qū)分不同的毒株并解釋它們之間的差異。 (3) 制備探針和標(biāo)記探針 PCR可為核酸雜交提供探針和標(biāo)記探針。由于 PCR對(duì)檢測(cè)的核酸有擴(kuò)增作用，理論上既使僅有一個(gè)分子的模板，也可進(jìn)行特異性擴(kuò)增，故特異性和靈敏度都很高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)，包括核酸雜交技術(shù)。 一般 PCR反應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對(duì)稱(chēng) PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為 50:1100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會(huì)被用完，大量生成一條單鏈的DNA， 分離單鏈即可直接進(jìn)行序列分析等研究。其基本方
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