分子生物學(xué)技術(shù)(文件)
【正文】 穩(wěn)定的復(fù)合物，通過連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì) (如酶、熒光素等 )進行檢測。 2. RNA探針 全基因 RNA探針可用 RNA病毒的基因標記即可；由 DNA轉(zhuǎn)錄出探針 RNA， 可由 RNA聚合酶獲得大量高純度的 RNA， 其靈敏度比 DNA探針高出 10多倍。 固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。例如。液相雜交與固相雜交的主要區(qū)別是不用純化或固定的靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。 為使核酸牢固結(jié)合在膜上，通常還將點樣后的膜進行 80℃ 真空烘烤 2h。常規(guī)處理如下，先用限制性內(nèi)切酶對 DNA樣品進行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將 得 DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈 DNA解離成單鏈，并將其轉(zhuǎn)移到 NC膜或其它固相支持物上，轉(zhuǎn)移后各 DNA片段的相對位置保持不變。 Northern印跡的方法與 Southern印跡基本相同，可參照進行。因此，在 Northern印跡前，須進行 RNA變性電泳，在電泳過程中使 RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進行印跡轉(zhuǎn)移。雜交反應(yīng)是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫 度和條件下進行復(fù)性反應(yīng)的過程。核酸探針可用以檢測任何特定病原微生物，并能鑒別密切相關(guān)的毒 (菌 )株和寄生蟲。 三、 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction， PCR)由美國Centus公司的 Kary Mullis發(fā)明，于 1985年由Saiki等在 Science雜志上首次報道，是近年來開發(fā)的體外快速擴增 DNA的技術(shù)。模板 DNA變性、引物結(jié)合 (退火 )、引物延伸合成 DNA這三步構(gòu)成一個 PCR循環(huán)。通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸 3個溫度的循環(huán)，模板上介于兩個引物之間的片段不斷得到擴增。除反轉(zhuǎn)錄 PCR外，尚有不對稱 PCR、 反向 PCR、 錨定 PCR、 多重 PCR、 著色互補 PCR、 免疫 PCR和套式PCR等。 (2) 錨定 PCR(Anchored PCR) 通常進行的PCR試驗必須知道欲擴增 DNA或 RNA片段兩側(cè)的序列，并以此為依據(jù)設(shè)計引物進行PCR。方法是使含已知序列和未知序列的 DNA片段環(huán)化，再用限制性內(nèi)切酶切開已知序列，這樣線性化后原位于已知序列兩側(cè)的未知序列變?yōu)槲挥谝阎蛄兄g，再經(jīng)常規(guī) PCR操作就可大量擴增未知序列。 (2) 快速、準確、安全檢測病原體 用 PCR技術(shù)不需經(jīng)過分離培養(yǎng)和富集病原體，一個 PCR反應(yīng)一般只需幾十分鐘至 2小時就可 完成。 PCR技術(shù)適用于檢測慢性感染、隱性感染，對于難于培養(yǎng)的病毒的檢測尤其適用。② 在反應(yīng)液中加入標記的 dNTP， 經(jīng) PCR將標記物摻入到新合成的 DNA鏈中，從而制得放射性和非放射性標記探針。 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。 PCR結(jié)合其它核酸分析技術(shù)，在精確區(qū)分病毒不同型、 不同株、不同分離物的相關(guān)性方面具有獨特的優(yōu)勢，可從分子水平上區(qū)分不同的毒株并解釋它們之間的差異。 (3) 制備探針和標記探針 PCR可為核酸雜交提供探針和標記探針。由于 PCR對檢測的核酸有擴增作用，理論上既使僅有一個分子的模板，也可進行特異性擴增，故特異性和靈敏度都很高，遠遠超過常規(guī)的檢測技術(shù)，包括核酸雜交技術(shù)。 一般 PCR反應(yīng)中兩種引物的量是相等的，不對稱 PCR中，兩種引物的量相差懸殊，一般為 50:1100:1，這樣在生成一定數(shù)量的雙鏈產(chǎn)物后，較少的引物就會被用完，大量生成一條單鏈的DNA， 分離單鏈即可直接進行序列分析等研究。其基本方
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