分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法(文件)
【正文】 p，常用為 20bp左右。 ④ 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間 互補(bǔ)，特別是 3‘端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二 聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。 ? 酶及其濃度 目前有２種 Taq DNA聚合酶， 催化一典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 (指總反應(yīng)體積為 100uＬ時(shí) )，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。 ? 在 PCR反應(yīng)中 ， dNTP應(yīng)為 50200umol/L，尤其是注意 4種 dNTP的濃度要相等 (等摩爾配制 )， 如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí) (偏高或偏低 )， 就會(huì)引起 錯(cuò)配 。 SDS主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶 K能水解蛋白質(zhì)，特別是組蛋白，再用有機(jī)酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。 PCR的基本原理 DNA模板 DNA引物 dNTP TaqDNA聚合酶 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時(shí)間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 1 2 3 4 5 22 55 72 94 時(shí)間（ min） 溫度 （ ℃ ） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù) 1~3步 25~30輪 目的 DNA片段 擴(kuò)增 100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸 DNA加倍 DNA變性 形成2條單鏈 模板 DNA 95℃ PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 95℃ 50℃引物 1 引物 2 DNA引物 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 50℃ 引物 1 引物 2 DNA引物 72℃Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 72℃ 第 1輪結(jié)束 95℃第 2輪開始 PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 95℃ 50℃72℃Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 72℃ 第 2輪結(jié)束 ? PCR反應(yīng)條件 ? PCR過程 ? PCR的特點(diǎn) 重復(fù) 30輪后 230=1,073,741,824 模板 DNA 第 1輪擴(kuò)增 第 2輪擴(kuò)增 第 3輪擴(kuò)增 第 4輪擴(kuò)增 第 5輪擴(kuò)增 第 6輪擴(kuò)增 理想拷貝數(shù) =2n n 循環(huán)次數(shù) 實(shí)際拷貝數(shù) =(1+x)n X 平均效率 ,約為 n 循環(huán)次數(shù) 電泳分析 PCR設(shè)備 電泳分析 （ 4） PCR反應(yīng)特點(diǎn) 特異性強(qiáng)： PCR反應(yīng)的特異性決定因素為： ① 引物與模板 DNA特異正確的結(jié)合； ② 堿基配對(duì)原則； ③ Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性； ④ 靶基因的特異性與保守性。 再通過選擇特異性和保守性高 的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。 ? 研究 ? 基因克隆， DNA測(cè)序，分析突變 ? 診斷 ? 細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測(cè)，診斷 ? 人類基因組工程 ? 遺傳圖譜的構(gòu)建， DNA測(cè)序，表達(dá)圖譜 ? 法醫(yī) ? 犯罪現(xiàn)場(chǎng)標(biāo)本分析 ? 腫瘤 ? 各種腫瘤檢測(cè) ? 其他 …… ? 在臨床醫(yī)學(xué)上， PCR被用于鑒別遺傳疾病和快速檢測(cè)病毒、病菌感染。毛發(fā)、血跡、唾沫、精液因此都可以成為重要的罪證。 2. Taq Man探針三要素： 短波長熒光基團(tuán) 目的 DNA特異的堿基序列 長波長熒光基團(tuán) RNA基本操作技術(shù) （ 1）高質(zhì)量 mRNA的制備 應(yīng)用 Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分離 Poly(A)RNA。 5 ? 下面介紹測(cè)序的基本原理。4 核苷酸序列分析 ? MaxamGilbert化學(xué)修飾法 硫酸二甲酯、肼、六氫吡啶 → 放射標(biāo)記ＤＮＡ片段 → 堿基特異性切割→ 不同長度ＤＮＡ片段 → 凝膠電泳和放射自顯影 → 讀出ＤＮＡ序列。4 核苷酸序列分析 ? ＤＮＡ雜交測(cè)序法（ＳＢＨ）
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