分子生物學(xué)第五章分子生物學(xué)研究法(編輯修改稿)
2025-02-09 08:02 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 5年美國 PECetus公司人類遺傳研究室的 Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于 DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件 摸板 DNA ，寡核苷酸引物， DNA聚合酶，合適的緩沖體系， DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。 ? Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，其缺點是： ① Klenow酶不耐高溫， 90℃ 失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在 37℃ 下進行易發(fā)生堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的 DNA片段不均一。 PCR的改進與完善 ? 1988年初， Keohanog改用 T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的 DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種 DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。 PCR的改進與完善 ? 1988年， Saiki 等從溫泉中分離的一株 水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種 耐熱 DNA聚合酶。 ? 具有以下特點：① 耐高溫 。②熱變性不被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高擴增片段特異性和擴增效率，增加擴增長度 ()。 ? 此酶命名為 Taq DNA多聚酶 (Taq DNA Polymerase)。具有較高的特異性、靈敏性和效率，此酶的發(fā)現(xiàn)使 PCR廣泛的被應(yīng)用。 ? PCR即在體外模擬 DNA復(fù)制的過程，加熱變性使 DNA變成單鏈，人工合成 2個引物讓它們結(jié)合到 DNA模板的兩端， DNA聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。 （ 2） PCR技術(shù)的基本原理 ? 假定我們要研究的 DNA雙鏈兩端的序列是 ： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ? PCR前先人工合成兩段有 2030堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對，把這兩段引物和 DNA模板、 DNA聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合在一起，我們就可以開始做 PCR了。 ? 第一步 模板 DNA的變性 ： 模板 DNA經(jīng)加熱至 93℃ 左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 第二步 模板 DNA與引物的退火 (復(fù)性 )： 模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃ 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； ? 第三步 引物的延伸 ： DNA模板 引物結(jié)合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性 退火 延伸三過程，就可獲得更多的 “ 半保留復(fù)制鏈 ” ，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 每完成一個循環(huán)需 2～ 4分鐘， 2～ 3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 PCR反應(yīng) （ 3） PCR的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 標(biāo)準(zhǔn)的 PCR反應(yīng)體系 ： 10 擴增緩沖液 10ul 4種 dNTP混合物 各 200μmol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加雙或三蒸水至 100ul PCR的基本原理－ PCR反應(yīng)五要素 ：引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+ 引物： PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板 DNA 互補的程度。理論上，只要知道任何一段模 板 DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸 鏈做引物，利用 PCR就可將模板 DNA在體外 大量擴增。 循環(huán)次數(shù) : 循環(huán)次數(shù)決定了 PCR的擴增程度。 PCR 循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。 一般的循環(huán)次數(shù)選在 30～ 40次之間，循 環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之 增多。 設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則： ①引物長度 : 1530bp，常用為 20bp左右。 ②引物擴增跨度：以 200500bp為宜，特定條件下可擴 增長至 10kb的片段。 ③引物堿基： G+C含量以 4060%為宜， G+C太少擴增 效果不佳， G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC最好隨機分布，避免 5個以上的嘌 呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④ 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間 互補，特別是 3‘端的互補，否則會形成引物二 聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。 ⑤ 引物 3‘端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿 基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配 對而導(dǎo)致 PCR失敗。 ⑥ 引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的 靶序列最好有適宜的酶切位點， 這
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