分子生物學要點(編輯修改稿)
2025-05-04 03:17 本頁面
【文章內容簡介】 子受體自身被磷酸化后，不僅其激酶活性增強，而且其構象發(fā)生變化，從而適合與含SH2結構域的蛋白分子相結合。Grb2是作為接頭蛋白結合到受體上。 調控分子SOS的活化:SOS含有可與SH3結構域相結合的富含脯氨酸基序，當Grb2結合到磷酸化的表皮生長因子受體后，它的兩個SH3結構域即可結合SOS，使之活化。低分子量G蛋白Ras的活化:SOS可促進Ras釋放GDP，結合GTP的反應，使Ras激活?；罨腞as作用其下游分子Raf，使之活化。Raf是MAPK級聯反應的第一個分子，由此啟動了MAPK的三級激活過程。MAPK的級聯激活:Raf是一種MAPKKK，它作用于MEK，使之磷酸化而激活，活化的MEK在作用于MAPK家族的ERK1，使之磷酸化激活由此完成了三級激活。轉錄因子的磷酸化及轉錄調控作用:活化的ERK可以轉至細胞核內，使某些轉錄調控因子發(fā)生磷酸化，從而影響基因的轉錄。（七）、cAMP信號轉導途徑？答:組成:胞外信息分子（主要是胰高血糖素、腎上腺素和促腎上腺皮質激素），受體，G蛋白，AC，cAMP , PKA。途徑: v信號分子與受體結合，引起受體構象變化 v受體活化G蛋白 活化后的G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶（AC） v vAC催化ATP生成cAMP cAMP活化PKA，PKA使目標蛋白磷酸化，調節(jié)代謝酶的活性或調節(jié)基因的表達v（八）、IP3Ca2+信號途徑: 信號分子與受體結合，引起受體構象變化 v受體活化G蛋白 v活化后的G蛋白激活PLC PLC水解PIP2生成IP3 和DGv vIP3 使鈣通道打開，細胞內Ca2+升高 Ca2+與CaM結合，激活Ca2+CaM依賴的蛋白激酶v Ca2+CaM依賴的蛋白激酶使目標蛋白磷酸化。（九）、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件？答:（1）、常用的工具酶限制性核酸內切酶:是細菌產生的一類能識別和切割雙鏈DNA分子內特定的堿基順序的核酸水解酶。DNA連接酶:將兩段DNA分子拼接起來的酶。DNA聚合酶:催化單核苷酸鏈延伸。逆轉錄酶:依賴于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉錄RNA成為DNA的酶，產物DNA又稱互補DNA。末端脫氧核糖核酸轉移酶:將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。堿性磷酸酶:催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團。依賴DNA的RNA聚合酶:識別特異性啟動子，RNA轉錄。 （2）、良好載體的條件 必須有自身的復制子；載體分子上必須有限制性核酸內切酶的酶切位點，即多克隆位點，以供外源DNA插入；載體應具有可供選擇的遺傳標志，以區(qū) 別陽性重組子和陰性重組子；載體分子必須有足夠的容量；可通過特定的方法導入細胞；對于表達載體還應具備與宿主細胞相適應的啟動子、前導順 序、增強子、加尾信號等DNA調控元件。（十）、藍白篩選的原理？答:某些質粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的 基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的DNA序列。這些位點上如果沒有克隆外源性DNA片段，在質粒被導入lac的大腸桿菌后，質粒攜帶的半 乳糖苷酶基因將正常表達，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物Xgal和誘導劑IPTG后，出現藍色的菌落。如果在 多克隆位點上插入外源DNA片段，將使lac Z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結果菌落出現白色。由于這種顏色標志，重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然。（十一）SANGER雙脫氧鏈終止法的原理？答DNA 鏈中核苷酸以3’,5’磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物是 2’脫氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP與普通dNTP不同，它們在脫氧核糖的3’位置缺少一個羥基。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸 的DNA鏈中，但由于沒有3’羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。在DNA合成反應混合物的4種普通 dNTP中加入少量的一種ddNTP，鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭，產物是一系列的核苷酸鏈，其長度取決于引物末端到出現過早鏈終止位置 間的距離。在4組獨立酶反應中分別采用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。（十二）、核酸分子雜交的原理？答:具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度及離子強度等）堿基互補配對結合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經歷了變性和復性的變化，以及在復性過程中個分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測核酸和已知序列。（十三）、影響雜交的因素？答:核酸分子的濃度和長度:核酸濃度越大，復性速度越快。探針長度應控制在50300個堿基對為好。 溫度:溫度過高不利于復性，而溫度過低，少數堿基配對形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM值低25度。 離子強度:在低離子強度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強度的增加，雜交反應率增加。高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，所以進行序列不完全同源的核酸分子雜交時必須維持雜交反應液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度。 雜交液中的甲酰胺:甲酰胺能降低核酸雜交的TM值。它有以下優(yōu)點:在低溫下探針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價結合的核酸。 核酸分子的復雜性:是指存在于反應體系中的不同順序的總長度。兩個不同基因組DNA變性后的相對雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時的相對復雜性（即DNA中的堿基數）。 非特異性雜交反應:在雜交前應對非特異性雜交反應位點進行封閉，以減少其對探針的非特異性吸附作用。（十四）、探針的種類和優(yōu)缺點？答:cDNA探針:通過逆轉錄獲得cDNA后，將其克隆于適當的克隆載體，通過擴增重組質粒而使cDNA得到大量的擴增。提取質粒后分離純化作為探針使用。它是目前應用最為廣泛的一種探針。基因組探針:從基因組文庫里篩選得到一個特定的基因或基因片段的克隆后，大量擴增、純化，切取插入片段，分離純化為探針。寡核苷酸探針:根據已知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針。4
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