分子生物學要點(已改無錯字)
2023-05-08 03:17:21 本頁面
【正文】 、RNA探針:采用基因克隆和體外轉錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針。（十五）、探針的標記法？答: 缺口平移法:此法是利用適當濃度的DNase Ⅰ在DNA雙鏈上隨機切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產生一個5末端和3末端，3末端就可以作為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互補的DNA 單鏈為摸板，依次將dNTP連接到切口的3末端的羥基上，合成新的DNA單鏈；同時DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切 除，新合成鏈不斷延伸，從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標記的核苷酸所取代。隨機引物法:隨機引物是人工合成的長度為6個寡核苷酸殘 基的寡聚核苷酸片段的混合物。對于任何一個用作探針的DNA片段，隨機引物混合物中都會有一些六核苷酸片段可以與之結合，起到DNA合成引物的作用。將這 些引物與變性的DNA單鏈結合后，以4種dNTP（其中一種是標記物標記的dNTP）為底物，合成與探針DNA互補的切帶有標記物的DNA探針。PCR標記法:在PCR反應底物中，將一種dNTP換成標記物標記的dNTP， 這樣標記的dNTP就在PCR反應的同時摻入到新合成的DNA鏈上。末端標記法:只是將DNA片段的一端進行標記。（十六）、PCR的基本原理？答PCR 是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理是依據(jù)細胞內DNA半保留復制的機理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉變的性質，人為地控 制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈 DNA。PCR全過程每一步的轉換是通過溫度的改變來控制的。需要重復進行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即 高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟構成PCR反應的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復進行，就可使目的DNA得以迅速擴增。DNA模板變性:模板雙鏈DNA174。單 鏈DNA，94℃。退火:引物＋單鏈DNA174。雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸:溫度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3’末端為起點的5’→3’DNA鏈延伸反應，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈 經過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應的模板PCR，就是如此反復循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴增。（十七）、PCR引物設計的基本要求？答:引物長度一般為15～30個核苷酸。過短影響PCR的特異性，過長會提高相應退火溫度，使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度74℃,影響產物的生成。引物的堿基盡可能隨機，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。3’端不應有連續(xù)3個G和C。否則會使引物和模板錯誤配對。G+C含量一般占45％ 55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值計算公式:Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)引物自身不應存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結構。引物的連續(xù)互補序列，一般不超過3bp。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其應避免3’端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不超過70％，引物3’末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3’端最佳堿基選擇是G和C，形成的堿基配對比較穩(wěn)定。引物與模板結合時，引物的5’端最多可以游離十幾個堿基而不影響PCR反應的進行。引物的5’端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等。（十八）、PCR的反應條件？答:PCR反應的緩沖液: l TrisHCl緩沖液 lKCl 促進引物的退火，濃度太高時會抑制Taq DNA聚合酶活性。 加入BSA或明膠有利于保護TaqDNA聚合酶活性。 必要時加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結構，提高PCR反應特異性。 鎂離子濃度 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+濃度過低，會顯著降低酶活性。Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。Mg 2+濃度還會影響引物的退火、模板與PCR產物的解鏈溫度，從而影響擴增片段的產率。 底物濃度 工作濃度20200umol/L， dNTPs濃度過高可加快反應速度，也增加堿基的錯配率和實驗成本。降低濃度會導致反應速度下降，可提高反應的特異性。在PCR反應中，4種dNTP必須 以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應的錯配誤差并提高使用效率。Taq DNA聚合酶 7580℃時具有最高的聚合酶活性，150個核苷酸/秒；具有良好的熱穩(wěn)定性，95℃仍有活性。引物 。引物濃度偏高會引起錯配或非特異性擴增、生成引物二聚體，使目的DNA片段產率下降。退火溫度與引物Tm值有關，引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想。 反應溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達的因素？答:啟動子的強弱；基因的劑量；影響RNA轉錄和翻譯效率的因素:SD序列、mRNA；外源基因密碼子的選擇；表達產物的大?。槐磉_產物的穩(wěn)定性。（二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達外源基因必須具備的條件？答:要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內含子；表達的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游，并形成正確的閱讀框架；轉錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質。蛋白產物必須穩(wěn)定，不易被細胞內蛋白酶快速降解，且對宿主無害。（二十一）、真核細胞表達外源基因的條件？答:首先必須具備哺乳動物細胞表達的功能元件。要求哺乳動物細胞表達載體帶有能在真核細胞中表達外源基因的真核轉錄調控元件；注意選擇轉染的受體細胞，不同類型的細胞具有不同的特性；注意選擇適當?shù)倪x擇標記。（二十二）、轉基因動物的概念、原理及應用？答:概念:是指用人工方法將外源基因導入或整合到基因組內，并能穩(wěn)定傳代的一類動物。它的特點是“分子及細胞水平操作，組織及動物整體水平表達”。 基本原理:將目的基因或基因組片段用顯微注
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