細(xì)胞與分子生物學(xué)(已改無錯字)
2023-05-05 23:49:23 本頁面
【正文】 H2O P10,T8 (13) PC RNA1 P10,T8 (14) PC RNA2 P10,T8 在PCR 管中加入:① cDNA樣品 1μl P 引物 1μl T 引物 1μl② 準(zhǔn)備其它 PCR試劑的混合液: (在另一管中加入) 成分 每管(μl) 所需管數(shù)( n=14) 10buffer 2n ddH2O 14n dNTPmix α32P dATP Taq酶 終體積 17 n 混勻后稍離心。③ 將17μl PCR混合液加入各反應(yīng)管，則各管總體積為20μl。④ 開始PCR擴(kuò)增。⑤ PCR循環(huán)參數(shù)： 在GeneAmp PCR Systems 2400 amp。 9600 擴(kuò)增儀上執(zhí)行以下程序：94℃ 5min 1 cycles 40℃ 5min 68℃ 5min 94℃ 30sec 2 cycles 40℃ 30sec 68℃ 5min 94℃ 20sec 23 cycles 40℃ 30sec 68℃ 2min 1 cycles 68℃ 7 min。⑥ 反應(yīng)結(jié)束后置20℃保存?zhèn)溆谩?4．電泳和放射自顯影(1）配制6%變性聚丙烯酰胺凝膠，灌注測序板。(2）預(yù)電泳30min。(3）每個ddPCR反應(yīng)取出5μl于一新 微量離心管中，加5μl loading buffer，混勻，離心，置94℃變性2min。立即置冰浴。(4) 停止預(yù)電泳，沖洗加樣孔。(5) 加樣2μl。(6）下膠：（同測序膠）(7）干膠：在膠表面覆上保鮮膜，80℃干膠30min。(8)X光片70℃曝光過夜或更長時間(根據(jù)射線強(qiáng)度而定)。圖26顯示了ddPCR放射自顯影的X光片5．差異條帶回收再擴(kuò)增(1）X光片經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片燈上比較尋找差異條帶。（
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