細(xì)胞與分子生物學(xué)-wenkub
2023-04-19 23:49:23 本頁面
【正文】 al chemicals research was also exp lored in the paper.Keyword s: mRNA differential display Heterosis Resistance ACP 許多年以來，分離差異表達(dá)基因的方法僅限于差異篩選cDNA文庫，直到1992 年Liang等發(fā)明了一種檢測基因轉(zhuǎn)錄模式的方法，即mRNA 差異顯示技術(shù)(mRNA Differential Display Reverse TranscriptionPCR, DDRTPCR)[1]，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因，差別基因表達(dá)（differential gene express）是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)[2]。ACP DDRTPCR技術(shù) 摘 要：隨著基因組計(jì)劃的順利實(shí)施,大量的生物信息被解析,分離和鑒定差異表達(dá)基因已成為分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。mRNA差別顯示技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)的基因進(jìn)行分離的一種快速而行之有效的方法。這些方法各具獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也具有其自身不同的缺陷。許多研究者提出了各種辦法來提高引物退火的特異性，如在引物的5’端增加一段通用引物序列，或加一段同聚物，或加上一段環(huán)狀序列，以增加PCR 擴(kuò)增的特異性和退火的穩(wěn)定性，但這些方法并不能消除初始反應(yīng)的非特異性退火[7]。具體的引物結(jié)構(gòu)是（圖1）:退火控制引物由獨(dú)特的三部分組成，3＇端和5＇端部分由中間的調(diào)節(jié)部分連接。2 ACP技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 假陽性低假陽性高是目前克隆差異表達(dá)基因的瓶頸問題之一， ACP技術(shù)可使引物在初始反應(yīng)與模板鏈特異結(jié)合，擴(kuò)增出真實(shí)可靠的產(chǎn)物，從而降低了PCR 結(jié)果的假陽性。 重復(fù)性高由于ACP 采用簡單容易的操作就可得到結(jié)果，避免了繁復(fù)步驟引入誤差的機(jī)會(huì)，使得試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性大大提高。操作步驟1．總RNA的提?。ㄒ奛orthern 雜交）2．第一鏈合成：(1)總RNA樣品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O補(bǔ)至5μl。(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍離心。(8)將2μl反應(yīng)液分別轉(zhuǎn)至新管中（新管標(biāo)號(hào)為1B,2B,PC B等）。3．ddPCR：以引物P1,T9為例說明 （ PCR管,1代表對照組,2代表實(shí)驗(yàn)組） 管號(hào) cDNA樣品 引物 (1) 1A P1,T9 (2) 1B P1,T9 (3) 2A P1,T9 (4) 2B P1,T9 (5) H2O P1,T9 (6) RNA1 P1,T9 (7) RNA2
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