分子生物學要點(參考版)
2025-04-10 03:17本頁面
【正文】 ４）DNA序列： 原核生物無或很少有重復序列，真核生物有重復序列。２）染色體遺傳物質：原核生物為質粒，真核生物為細胞器基因組。 問答題。： mRNA上的三個相臨的核苷酸序列，稱三聯(lián)體密碼子，是蛋白質合成中某一氨基酸的編碼單位。13. 衰減子：在色氨酸操縱子中，當色氨酸濃度很高時，核糖體能夠很快的通過編碼序列１，而封閉編碼序列2,這種與轉錄偶聯(lián)的翻譯過程導致序列3,4形成一個不 依賴p因子的終止結構稱衰減子，它能夠使前方的RNA聚合酶脫落，從而導致轉錄終止，類似的結構在其他氨基酸操縱子中也存在。：各類不同的細胞中均有相同的一組基因在表達，它們的功能對每個細胞都是必需的，這類基因稱持家基因。：當核酸分子加熱變性時，其在260nm處的紫外吸收值急劇增加的現(xiàn)象稱增色效應。：基因組獨立進行復制的單位稱復制子，每個復制子都有復制起點和復制終點。：以RNA為模板，以四種dNTP在逆轉錄酶的作用下合成DNA的過程叫作逆轉錄。７. hnRNA：—種核不均一RNA，即mRNA的前體，經過5’加帽和 3’酶切加多聚A，再經過RNA的剪接，將外顯子連接成開放閱讀框，通過核孔進入細胞質就可以作為蛋白質合成的模板了。它與核糖體16S rRNA 3‘末端富含嘧啶的序列互補，是核糖體的識別位點。：是一種具自身催化RNA切割和RNA剪接功能的由RNA組成的酶，可以作為基因表達和病毒復制的抑制劑。包括啟動子、上游啟動子元件、增強子、加尾信號和一些反應元件等。單順反子：在真核生物中，一個編碼基因多轉錄成一個mRNA分子，經翻譯只生成一條多肽鏈，這樣的一個轉錄單位稱為單順反子，真核生物中的基因都是以單順反子的形式存在。（二十九）、簡述重組DNA技術的過程?；驑擞?基因標記實驗是基因治療的前奏，并不在于直接治療疾病而是期望能夠提供有關正常細胞生物學和疾病病理方面的信息?；蛱砑踊蚍Q基因增補:通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。突變的遺傳效應:①遺傳密碼的改變:錯義突變、無義突變、同義突變、移碼突變② 對mRNA剪接的影響:一是使原來的剪接位點消失；二是產生新的剪接位點。③ 插入:一個原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。分為轉換和顛換。其方法包括芯片的制備、樣品的準備、分子雜交和檢測分子。 打靶載體的構建:同源序列要足夠長，要含有篩選用的標志基因。應用:建立用于研究外源基因表達調控體系；建立醫(yī)學中常用的疾病模型；培育動物新品種；藥理學和藥用蛋白的生產研究。它的特點是“分子及細胞水平操作，組織及動物整體水平表達”。要求哺乳動物細胞表達載體帶有能在真核細胞中表達外源基因的真核轉錄調控元件；注意選擇轉染的受體細胞，不同類型的細胞具有不同的特性；注意選擇適當?shù)倪x擇標記。蛋白產物必須穩(wěn)定，不易被細胞內蛋白酶快速降解，且對宿主無害。 反應溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達的因素？答:啟動子的強弱；基因的劑量；影響RNA轉錄和翻譯效率的因素:SD序列、mRNA；外源基因密碼子的選擇；表達產物的大??；表達產物的穩(wěn)定性。退火溫度與引物Tm值有關，引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想。引物 。在PCR反應中，4種dNTP必須 以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應的錯配誤差并提高使用效率。 底物濃度 工作濃度20200umol/L， dNTPs濃度過高可加快反應速度，也增加堿基的錯配率和實驗成本。 Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。 鎂離子濃度 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。 加入BSA或明膠有利于保護TaqDNA聚合酶活性。 （十八）、PCR的反應條件？答:PCR反應的緩沖液: 引物與模板結合時，引物的5’端最多可以游離十幾個堿基而不影響PCR反應的進行。引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其應避免3’端的互補重疊。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值計算公式:Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)引物自身不應存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結構。否則會使引物和模板錯誤配對。引物的堿基盡可能隨機，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。（十七）、PCR引物設計的基本要求？答:引物長度一般為15～30個核苷酸。引物的延伸:溫度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3’末端為起點的5’→3’DNA鏈延伸反應，形成新生DNA鏈。退火:引物＋單鏈DNA174。DNA模板變性:模板雙鏈DNA174。PCR全過程每一步的轉換是通過溫度的改變來控制的。末端標記法:只是將DNA片段的一端進行標記。將這 些引物與變性的DNA單鏈結合后，以4種dNTP（其中一種是標記物標記的dNTP）為底物，合成與探針DNA互補的切帶有標記物的DNA探針。隨機引物法:隨機引物是人工合成的長度為6個寡核苷酸殘 基的寡聚核苷酸片段的混合物。（十五）、探針的標記法？答: 缺口平移法:此法是利用適當濃度的DNase Ⅰ在DNA雙鏈上隨機切割單鏈，造成單鏈切口。寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針。它是目前應用最為廣泛的一種探針。（十四）、探針的種類和優(yōu)缺點？答:cDNA探針:通過逆轉錄獲得cDNA后，將其克隆于適當?shù)目寺≥d體，通過擴增重組質粒而使cDNA得到大量的擴增。 核酸分子的復雜性:是指存在于反應體系中的不同順序的總長度。它有以下優(yōu)點:在低溫下探針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價結合的核酸。 離子強度:在低離子強度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強度的增加，雜交反應率增加。 溫度:溫度過高不利于復性，而溫度過低，少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM值低25度。探針長度應控制在50300個堿基對為好。雜交的雙方是待測核酸和已知序列。在4組獨立酶反應中分別采用4種不同的ddNTP，結果將產生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團摻入到延伸 的DNA鏈中，但由于沒有3’羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷
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