分子生物學(xué)要點(diǎn)(參考版)
2025-04-10 03:17本頁(yè)面
【正文】 ４）DNA序列： 原核生物無(wú)或很少有重復(fù)序列，真核生物有重復(fù)序列。２）染色體遺傳物質(zhì)：原核生物為質(zhì)粒，真核生物為細(xì)胞器基因組。 問(wèn)答題。： mRNA上的三個(gè)相臨的核苷酸序列，稱三聯(lián)體密碼子，是蛋白質(zhì)合成中某一氨基酸的編碼單位。13. 衰減子：在色氨酸操縱子中，當(dāng)色氨酸濃度很高時(shí)，核糖體能夠很快的通過(guò)編碼序列１，而封閉編碼序列2,這種與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的翻譯過(guò)程導(dǎo)致序列3,4形成一個(gè)不 依賴p因子的終止結(jié)構(gòu)稱衰減子，它能夠使前方的RNA聚合酶脫落，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，類似的結(jié)構(gòu)在其他氨基酸操縱子中也存在。：各類不同的細(xì)胞中均有相同的一組基因在表達(dá)，它們的功能對(duì)每個(gè)細(xì)胞都是必需的，這類基因稱持家基因。：當(dāng)核酸分子加熱變性時(shí)，其在260nm處的紫外吸收值急劇增加的現(xiàn)象稱增色效應(yīng)。：基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子都有復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn)。：以RNA為模板，以四種dNTP在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA的過(guò)程叫作逆轉(zhuǎn)錄。７. hnRNA：—種核不均一RNA，即mRNA的前體，經(jīng)過(guò)5’加帽和 3’酶切加多聚A，再經(jīng)過(guò)RNA的剪接，將外顯子連接成開放閱讀框，通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)就可以作為蛋白質(zhì)合成的模板了。它與核糖體16S rRNA 3‘末端富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體的識(shí)別位點(diǎn)。：是一種具自身催化RNA切割和RNA剪接功能的由RNA組成的酶，可以作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑。包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等。單順?lè)醋樱涸谡婧松镏?，一個(gè)編碼基因多轉(zhuǎn)錄成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯只生成一條多肽鏈，這樣的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位稱為單順?lè)醋?，真核生物中的基因都是以單順?lè)醋拥男问酱嬖?。（二十九）、?jiǎn)述重組DNA技術(shù)的過(guò)程。基因標(biāo)記:基因標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是基因治療的前奏，并不在于直接治療疾病而是期望能夠提供有關(guān)正常細(xì)胞生物學(xué)和疾病病理方面的信息。基因添加或稱基因增補(bǔ):通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。突變的遺傳效應(yīng):①遺傳密碼的改變:錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、同義突變、移碼突變② 對(duì)mRNA剪接的影響:一是使原來(lái)的剪接位點(diǎn)消失；二是產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)。③ 插入:一個(gè)原來(lái)沒(méi)有的堿基或一段原來(lái)沒(méi)有的核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。分為轉(zhuǎn)換和顛換。其方法包括芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備、分子雜交和檢測(cè)分子。 打靶載體的構(gòu)建:同源序列要足夠長(zhǎng)，要含有篩選用的標(biāo)志基因。應(yīng)用:建立用于研究外源基因表達(dá)調(diào)控體系；建立醫(yī)學(xué)中常用的疾病模型；培育動(dòng)物新品種；藥理學(xué)和藥用蛋白的生產(chǎn)研究。它的特點(diǎn)是“分子及細(xì)胞水平操作，組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)”。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，不同類型的細(xì)胞具有不同的特性；注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解，且對(duì)宿主無(wú)害。 反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)（十九）、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素？答:啟動(dòng)子的強(qiáng)弱；基因的劑量；影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素:SD序列、mRNA；外源基因密碼子的選擇；表達(dá)產(chǎn)物的大小；表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。退火溫度與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想。引物 。在PCR反應(yīng)中，4種dNTP必須 以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。 底物濃度 工作濃度20200umol/L， dNTPs濃度過(guò)高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。 Mg 2+濃度過(guò)高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。 鎂離子濃度 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。 加入BSA或明膠有利于保護(hù)TaqDNA聚合酶活性。 （十八）、PCR的反應(yīng)條件？答:PCR反應(yīng)的緩沖液: 引物與模板結(jié)合時(shí)，引物的5’端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值計(jì)算公式:Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對(duì)。引物的堿基盡可能隨機(jī)，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。（十七）、PCR引物設(shè)計(jì)的基本要求？答:引物長(zhǎng)度一般為15～30個(gè)核苷酸。引物的延伸:溫度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3’末端為起點(diǎn)的5’→3’DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。退火:引物＋單鏈DNA174。DNA模板變性:模板雙鏈DNA174。PCR全過(guò)程每一步的轉(zhuǎn)換是通過(guò)溫度的改變來(lái)控制的。末端標(biāo)記法:只是將DNA片段的一端進(jìn)行標(biāo)記。將這 些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合后，以4種dNTP（其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP）為底物，合成與探針DNA互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的DNA探針。隨機(jī)引物法:隨機(jī)引物是人工合成的長(zhǎng)度為6個(gè)寡核苷酸殘 基的寡聚核苷酸片段的混合物。（十五）、探針的標(biāo)記法？答: 缺口平移法:此法是利用適當(dāng)濃度的DNase Ⅰ在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈，造成單鏈切口。寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核苷酸片段作為探針。它是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。（十四）、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)？答:cDNA探針:通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過(guò)擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA得到大量的擴(kuò)增。 核酸分子的復(fù)雜性:是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長(zhǎng)度。它有以下優(yōu)點(diǎn):在低溫下探針更穩(wěn)定；能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。 離子強(qiáng)度:在低離子強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強(qiáng)度的增加，雜交反應(yīng)率增加。 溫度:溫度過(guò)高不利于復(fù)性，而溫度過(guò)低，少數(shù)堿基配對(duì)形成的局部雙鏈不易解離，適宜的溫度是較TM值低25度。探針長(zhǎng)度應(yīng)控制在50300個(gè)堿基對(duì)為好。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知序列。在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。在DNA聚合酶作用下通過(guò)三磷酸基團(tuán)摻入到延伸 的DNA鏈中，但由于沒(méi)有3’羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷
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