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分子生物學(xué)要點(diǎn)(參考版)

2025-04-10 03:17本頁面
  

【正文】 4)DNA序列: 原核生物無或很少有重復(fù)序列,真核生物有重復(fù)序列。2)染色體遺傳物質(zhì):原核生物為質(zhì)粒,真核生物為細(xì)胞器基因組。 問答題。: mRNA上的三個(gè)相臨的核苷酸序列,稱三聯(lián)體密碼子,是蛋白質(zhì)合成中某一氨基酸的編碼單位。13. 衰減子:在色氨酸操縱子中,當(dāng)色氨酸濃度很高時(shí),核糖體能夠很快的通過編碼序列1,而封閉編碼序列2,這種與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的翻譯過程導(dǎo)致序列3,4形成一個(gè)不 依賴p因子的終止結(jié)構(gòu)稱衰減子,它能夠使前方的RNA聚合酶脫落,從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止,類似的結(jié)構(gòu)在其他氨基酸操縱子中也存在。:各類不同的細(xì)胞中均有相同的一組基因在表達(dá),它們的功能對每個(gè)細(xì)胞都是必需的,這類基因稱持家基因。:當(dāng)核酸分子加熱變性時(shí),其在260nm處的紫外吸收值急劇增加的現(xiàn)象稱增色效應(yīng)。:基因組獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱復(fù)制子,每個(gè)復(fù)制子都有復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制終點(diǎn)。:以RNA為模板,以四種dNTP在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA的過程叫作逆轉(zhuǎn)錄。7. hnRNA:—種核不均一RNA,即mRNA的前體,經(jīng)過5’加帽和 3’酶切加多聚A,再經(jīng)過RNA的剪接,將外顯子連接成開放閱讀框,通過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)就可以作為蛋白質(zhì)合成的模板了。它與核糖體16S rRNA 3‘末端富含嘧啶的序列互補(bǔ),是核糖體的識(shí)別位點(diǎn)。:是一種具自身催化RNA切割和RNA剪接功能的由RNA組成的酶,可以作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑。包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等。單順反子:在真核生物中,一個(gè)編碼基因多轉(zhuǎn)錄成一個(gè)mRNA分子,經(jīng)翻譯只生成一條多肽鏈,這樣的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位稱為單順反子,真核生物中的基因都是以單順反子的形式存在。(二十九)、簡述重組DNA技術(shù)的過程?;驑?biāo)記:基因標(biāo)記實(shí)驗(yàn)是基因治療的前奏,并不在于直接治療疾病而是期望能夠提供有關(guān)正常細(xì)胞生物學(xué)和疾病病理方面的信息。基因添加或稱基因增補(bǔ):通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。突變的遺傳效應(yīng):①遺傳密碼的改變:錯(cuò)義突變、無義突變、同義突變、移碼突變② 對mRNA剪接的影響:一是使原來的剪接位點(diǎn)消失;二是產(chǎn)生新的剪接位點(diǎn)。③ 插入:一個(gè)原來沒有的堿基或一段原來沒有的核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。分為轉(zhuǎn)換和顛換。其方法包括芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備、分子雜交和檢測分子。 打靶載體的構(gòu)建:同源序列要足夠長,要含有篩選用的標(biāo)志基因。應(yīng)用:建立用于研究外源基因表達(dá)調(diào)控體系;建立醫(yī)學(xué)中常用的疾病模型;培育動(dòng)物新品種;藥理學(xué)和藥用蛋白的生產(chǎn)研究。它的特點(diǎn)是“分子及細(xì)胞水平操作,組織及動(dòng)物整體水平表達(dá)”。要求哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件;注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞,不同類型的細(xì)胞具有不同的特性;注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記。蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定,不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解,且對宿主無害。 反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)(十九)、影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素?答:啟動(dòng)子的強(qiáng)弱;基因的劑量;影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素:SD序列、mRNA;外源基因密碼子的選擇;表達(dá)產(chǎn)物的大小;表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。退火溫度與引物Tm值有關(guān),引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想。引物 。在PCR反應(yīng)中,4種dNTP必須 以等摩爾濃度配制,以減少PCR反應(yīng)的錯(cuò)配誤差并提高使用效率。 底物濃度 工作濃度20200umol/L, dNTPs濃度過高可加快反應(yīng)速度,也增加堿基的錯(cuò)配率和實(shí)驗(yàn)成本。 Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。 鎂離子濃度 mmol/L,Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。 加入BSA或明膠有利于保護(hù)TaqDNA聚合酶活性。 (十八)、PCR的反應(yīng)條件?答:PCR反應(yīng)的緩沖液: 引物與模板結(jié)合時(shí),引物的5’端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點(diǎn),因此一定要與模板DNA配對。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值計(jì)算公式:Tm=4(G+C)+ 2(A+T)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。否則會(huì)使引物和模板錯(cuò)誤配對。引物的堿基盡可能隨機(jī),避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。(十七)、PCR引物設(shè)計(jì)的基本要求?答:引物長度一般為15~30個(gè)核苷酸。引物的延伸:溫度至70 ℃左右, Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料,以目的DNA為模板,催化以引物3’末端為起點(diǎn)的5’→3’DNA鏈延伸反應(yīng),形成新生DNA鏈。退火:引物+單鏈DNA174。DNA模板變性:模板雙鏈DNA174。PCR全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。末端標(biāo)記法:只是將DNA片段的一端進(jìn)行標(biāo)記。將這 些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合后,以4種dNTP(其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP)為底物,合成與探針DNA互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的DNA探針。隨機(jī)引物法:隨機(jī)引物是人工合成的長度為6個(gè)寡核苷酸殘 基的寡聚核苷酸片段的混合物。(十五)、探針的標(biāo)記法?答: 缺口平移法:此法是利用適當(dāng)濃度的DNase Ⅰ在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈,造成單鏈切口。寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序,采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針。它是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。(十四)、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)?答:cDNA探針:通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后,將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體,通過擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA得到大量的擴(kuò)增。 核酸分子的復(fù)雜性:是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。它有以下優(yōu)點(diǎn):在低溫下探針更穩(wěn)定;能更好地保留非共價(jià)結(jié)合的核酸。 離子強(qiáng)度:在低離子強(qiáng)度下,核酸雜交非常緩慢,隨著離子強(qiáng)度的增加,雜交反應(yīng)率增加。 溫度:溫度過高不利于復(fù)性,而溫度過低,少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離,適宜的溫度是較TM值低25度。探針長度應(yīng)控制在50300個(gè)堿基對為好。雜交的雙方是待測核酸和已知序列。在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸,它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸 的DNA鏈中,但由于沒有3’羥基,不能同后續(xù)的dNTP形成磷
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