分子生物學(xué)試題(參考版)
2025-08-07 14:16本頁面
【正文】 。③ 突變的遺傳效應(yīng)：①遺傳密碼的改變：錯義突變、無義突變、同義突變、移碼突變② ④ ③ ② 點(diǎn)突變：DNA大分子上一個(gè)堿基的變異。其方法包括芯片的制備、樣品的準(zhǔn)備、分子雜交和檢測分子。 胚泡植入假孕小鼠的子宮中 同源重組胚胎干細(xì)胞的篩選 胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 打靶載體的構(gòu)建：同源序列要足夠長，要含有篩選用的標(biāo)志基因。（二十三）、基因敲除的基本程序？答：通過DNA同源重組，使得胚胎干細(xì)胞特定的內(nèi)源基因被破壞而造成功能喪失，然后通過胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)得到該基因喪失的小鼠模型的過程稱為基因敲除。基本原理：將目的基因或基因組片段用顯微注射等方法注入實(shí)驗(yàn)動物的受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞中，使目的基因整合到基因組中，然后將此受精卵或著床前的胚胎細(xì)胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物，人們可以通過分析轉(zhuǎn)基因和動物表型的關(guān)系，揭示外源基因的功能；也可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良的動物品種。（二十二）、轉(zhuǎn)基因動物的概念、原理及應(yīng)用？答：概念：是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動物。（二十一）、真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件？答：首先必須具備哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的功能元件。（二十）、大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件？答：要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子；表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游，并形成正確的閱讀框架；轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì)。退火溫度與引物Tm值有關(guān)，引物Tm值在5580 ℃ 范圍較為理想。引物 。在PCR反應(yīng)中，4種dNTP必須以等摩爾濃度配制，以減少PCR反應(yīng)的錯配誤差并提高使用效率。 底物濃度 工作濃度20200umol/L， dNTPs濃度過高可加快反應(yīng)速度，也增加堿基的錯配率和實(shí)驗(yàn)成本。Mg 2+濃度還會影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。Mg 2+濃度過低，會顯著降低酶活性。 必要時(shí)加入適量二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺利于破壞模板二級結(jié)構(gòu)，提高PCR反應(yīng)特異性。 加入BSA或明膠有利于保護(hù)TaqDNA聚合酶活性。 KCl 促進(jìn)引物的退火，濃度太高時(shí)會抑制Taq DNA聚合酶活性。引物的5’端可以修飾，如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等（十八）、PCR的反應(yīng)條件？答：PCR反應(yīng)的緩沖液： ? 引物3’端最佳堿基選擇是G和C，形成的堿基配對比較穩(wěn)定。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70％，引物3’末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過3bp。G+C含量一般占45％ 55％。3’端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C。過短影響PCR的特異性，過長會提高相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度74℃,影響產(chǎn)物的生成。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。退火：引物＋單鏈DNA?雜交鏈，引物的Tm值。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸３個(gè)步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個(gè)循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。（十六）、PCR的基本原理？答：PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR標(biāo)記法：在PCR反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP， 這樣標(biāo)記的dNTP就在PCR反應(yīng)的同時(shí)摻入到新合成的DNA鏈上。對于任何一個(gè)用作探針的DNA片段，隨機(jī)引物混合物中都會有一些六核苷酸片段可以與之結(jié)合，起到DNA合成引物的作用。切口處產(chǎn)生一個(gè)5末端和3末端，3末端就可以作為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為摸板，依次將dNTP連接到切口的3末端的羥基上，合成新的DNA單鏈；同時(shí)DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代。RNA探針：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針。基因組探針：從基因組文庫里篩選得到一個(gè)特定的基因或基因片段的克隆后，大量擴(kuò)增、純化，切取插入片段，分離純化為探針。提取質(zhì)粒后分離純化作為探針使用。非特異性雜交反應(yīng)：在雜交前應(yīng)對非特異性雜交反應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行封閉，以減少其對探針的非特異性吸附作用。核酸分子的復(fù)雜性：是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度。雜交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸雜交的TM值。離子強(qiáng)度：在低離子強(qiáng)度下，核酸雜交非常緩慢，隨著離子強(qiáng)度的增加，雜交反應(yīng)率增加。探針長度應(yīng)控制在50300個(gè)堿基對為好。雜交的雙方是待測核酸和已知序列。在4組獨(dú)立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP，結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸，它們將分別終止于模板鏈的A、C、G或T位置。在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中，但由于沒有3’羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的DNA鏈不能繼續(xù)延伸。十一）SANGER雙脫氧鏈終止法的原理？答：DNA鏈中核苷酸以3’,5’磷酸二酯鍵連接，合成DNA所用的底物
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