【正文】 :1) SMAD最早被證實(shí)的TβRⅠ激酶的底物,可將其歸結(jié)成三大類：受體調(diào)節(jié)的SMADs (R SMADs), 共同的偶配體SMADs (CoSMADs), 抑制性SMADs (I。3）TPK在細(xì)胞的生長、增殖、分化等過程起重要的調(diào)節(jié)作用，并與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系。：1）受體型TPKRasMAPK途徑組成：催化性受體，GRB2, SOS, Ras蛋白, Raf蛋白，MAPK系統(tǒng)。2）生理效應(yīng)：PKG使有關(guān)蛋白或酶類的絲、蘇氨酸殘基磷酸化，如心鈉素、NO舒張血管平滑肌。對膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能、機(jī)體代謝、基因表達(dá)、細(xì)胞分化和增殖等的調(diào)節(jié)起作用。 3）PKC的生理功能：① 調(diào)節(jié)代謝活化的PKC引起一系列靶蛋白的絲 、蘇氨酸殘基磷酸化。+－依賴性蛋白激酶途徑：1）Ca2+－ 磷脂依賴性蛋白激酶途徑組成:胞外信息分子，G蛋白，磷脂酶C (PLC)，甘油二酯 (DAG)，三磷酸肌醇(IP3 )，蛋白激酶C (PKC)。酶或其他功能蛋白224。第二信使224。Ｇ蛋白224。 2）信息傳遞：激素224。：1）磷酸化與脫磷酸化作用；2）膜磷脂的代謝的影響；3）酶促水解作用；4）Ｇ蛋白的調(diào)節(jié)。受體的結(jié)構(gòu)：高度可變區(qū)，DNA結(jié)合區(qū)，激素結(jié)合區(qū)，鉸鏈區(qū)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)換信號的方式又分為三大類：離子通道受體，G蛋白偶聯(lián)受體和單跨膜受體。 PI（5）P2———PI（5）P3 。 Kinase：1）被許多GF及Oncogene激活；2）催化：PI ——PI3P。：1）是一個(gè)大家族,分為兩大類：蛋白絲/蘇氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶。3）α亞基可結(jié)合GTP或GDP,并有GTP酶活性,αGTP可活化下游信號分子,βγ亞基是調(diào)節(jié)亞基。2）異三聚體G protein由三個(gè)亞基α,β,γ組成。4）PTK抑制劑中可篩選抗癌藥。2）分為兩大類:受體型PTK—許多生長因子受體；非受體型PTK,如src,abl,FAK。3）MAPK是多條信號通路的交匯點(diǎn),與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡有關(guān)。：1）受Ca2+ 和二?；视停―AG）激活；2）參與細(xì)胞多項(xiàng)生理活動。3. cAMP 蛋白激酶Ａ途徑：組成：胞外信息分子，受體，G蛋白，腺苷酸環(huán)化酶 (adpenylate cyclase，AC)， cAMP，蛋白激酶 A(protein kinase A，PKA)4. PKA：1）由四個(gè)亞基組成：R2C2 （R調(diào)節(jié)亞基，C催化亞基）；2）被cAMP激活： 3）催化多種蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸磷酸化。受體對信號進(jìn)行轉(zhuǎn)換并啟動細(xì)胞內(nèi)信使系統(tǒng)224。擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞224。十二、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：：① 通過相鄰細(xì)胞直接接觸（直接通訊）：A）.間隙連由連接蛋白形成,允許小分子和離子通過；B）.細(xì)胞表面分子 互相識別、粘附介導(dǎo)的通訊；C）.突觸連接 介導(dǎo)的通訊(神經(jīng)系統(tǒng))；② 通過細(xì)胞分泌各種化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的代謝和功能（間接通訊)：內(nèi)分泌信號；旁分泌信號；自分泌信號。：1） 溫度；2）探針堿基組成及其濃度；3）靶核酸長度、堿基組成及其濃度；4）雜交液的組成。洗脫、濃縮 、真空干燥224。降解模板(總RNA或mRNA ) 224。 討論：若用Cy3dCTP或Cy5dCTP(分別標(biāo)記2種樣品)，則應(yīng)相應(yīng)調(diào)整其余3種dNTP的濃度。：1)完全互補(bǔ)性：對靶序列 的保守區(qū)而言；2)高度特異性：對基因家族的某個(gè)成員或?qū)Σ煌? 生物 種屬的同一基因而言；3)探針的豐度：針對靶基因序列設(shè)計(jì)多個(gè)(3個(gè)以上)寡核苷酸探針；4)設(shè)計(jì)單堿基錯(cuò)配即MM(mismatch)探針：作內(nèi)參照(衡量探針的特異性)。探針。5）空間位阻效應(yīng)：探針224。3）雜交反應(yīng)動力學(xué)：呈線性關(guān)系。 合成反應(yīng). :1）芯片的雜交類型：固液相雜交(固相：探針；液相：靶分子核酸)。分子印章(涂布)224。脫保護(hù)，偶聯(lián)第二個(gè)核苷酸(如dCMP)224。 加入單核苷酸(如dTMP)的亞磷酰胺活化端與活性羥基(OH)發(fā) 生化學(xué)偶聯(lián) ,光敏保護(hù)非活化端224。 (5)結(jié)果與討論：(一)顯微光蝕刻技術(shù)：經(jīng)化學(xué)處理,支持物表面活性羥基(OH) 連接光敏保護(hù)基(X) 選用光刻掩模(M1)保護(hù)非聚合部位224。(3)．雜交反應(yīng)與雜交后清洗:芯片雜交與常規(guī)分子雜交相似。:(1)探針的設(shè)計(jì)與芯片的制作：設(shè)計(jì)，制備，玻片的多聚L賴氨酸預(yù)處理，探針的打印與固化。4）受專利保護(hù)。3）調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。:1）抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞：；；；?；剌敾純后w內(nèi)224。導(dǎo)入生長、分裂的細(xì)胞224。2）ADA缺陷導(dǎo)致SCID的分子機(jī)制：ADA或PNP缺失導(dǎo)致dATP或dGTP在細(xì)胞內(nèi)積蓄，對早期T、B細(xì)胞發(fā)育有毒性作用，使之停滯于proT/proB階段，引起嚴(yán)重聯(lián)合型免疫缺陷（SCID）.3）基因治療研究：ADAgene + vector （逆轉(zhuǎn)錄病毒）224。3）核酶催化作用的特點(diǎn)：A)都有一個(gè)活性中心，催化時(shí)形成中間復(fù)合物，具有比蛋白質(zhì)酶更高的底物特異性；B)核酶對底物的切點(diǎn)處序列普遍為含GU序列。1）能進(jìn)行分子內(nèi)自我催化的RNA片段不很長，通常為60個(gè)核苷酸左右。技術(shù)方法：反義核酸技術(shù)；反義核酸核酶技術(shù)；細(xì)胞內(nèi)抗體( intrabody )技術(shù) 等等。3）基因干預(yù) 是指采用特定的手段，抑制或阻斷某個(gè)基因的表達(dá)?；蚨c(diǎn)突變、定點(diǎn)敲除和定點(diǎn)修復(fù)均屬于基因打靶(gene targeting)技術(shù)。顯然, 當(dāng)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)入neo基因后，就會在含G418的選擇性培養(yǎng)基中存活，而未轉(zhuǎn)入neo基因的細(xì)胞則不能生存。基因組分為3個(gè)區(qū)：第1個(gè)區(qū)為LTR(含增強(qiáng)子、啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和終止信號)；第2個(gè)區(qū)為ψ序列 (其編碼產(chǎn)物能有效包裝病毒基因組進(jìn)入病毒顆粒)；第3個(gè)區(qū)含3個(gè)結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env)。：1）逆轉(zhuǎn)錄病毒科是RNA病毒。：1）目標(biāo)基因?qū)氚屑?xì)胞的方法分為兩類：病毒學(xué)方法和非病毒學(xué)方法。目前此類方法常用。特點(diǎn)：離體培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因后回輸至患者體內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便；缺點(diǎn)：基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的效率都較低。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選和鑒定224。載體的選擇224。：目的基因的選擇與制備224。：1）Southern印跡雜交及限制性酶譜分析法：A）.α和ζ珠蛋白基因探針制備；B）內(nèi)切酶譜結(jié)果鑒定。（D）.靜止型 a地中海貧血：基因型：a / a a ( a + 地貧雜合子 )，僅缺失1個(gè)a 基因，無癥狀。缺失2個(gè) a 基因，間或有輕度貧血，我國主要是a 0地貧雜合子?；颊咧荒芎铣缮倭縜鏈， β 鏈形成 β 四聚體(β 4)，易被氧化，解聚成游離的單鏈，并積聚成包涵體，附著于紅細(xì)胞膜并使之受損，失去柔韌性，易被脾臟破壞，導(dǎo)致中度或較嚴(yán)重的溶血性貧血，稱為血紅蛋白 H病 ( Hb H disease )。Hb Bart對氧的親和力極高，造成組織嚴(yán)重缺氧, 導(dǎo)致胎兒水腫, 引起死胎或新生兒死亡。 2）α 地貧的基因型： α / αα (稱α+ 地貧)； / αα (稱αo 地貧). 3）α地貧的臨床類型： （A）.Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征：基因型 / ，稱為α0 地貧純合子。9. α 地中海貧血：1）α地中海貧血(αthalassemia,簡稱α地貧)。：1）中等長度 ()的DNA片段缺失或插入，可用一對引物的普通PCR檢測,根據(jù)結(jié)果作出判斷。：初篩用PCRSSCP分析法； 確認(rèn)用DNA 測序。經(jīng)PCR擴(kuò)增出突變區(qū)的CAN片段，然后直接點(diǎn)在膜上，與相應(yīng)的寡核苷酸探針雜交，即可檢測出DNA樣品是否有突變，以及診斷受檢者是突變純合子還是雜合子。 影響結(jié)果的因素頗多。 缺點(diǎn) ：準(zhǔn)確性不如DNA測序。2）應(yīng)用：廣泛用于大批樣品基因突變的檢測(初篩)。3）操作步驟：；；。利用該法可檢測細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。4）應(yīng)用：用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因表達(dá)譜的研究等。 3）特點(diǎn)：探針量靶基因片段(量) 。 芯片技術(shù)或稱DNA微陣列技術(shù)：1）為一項(xiàng) 高密度集成探針的雜交技術(shù)。：1）分別將實(shí)驗(yàn)組和扣除組的mRNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)組利用mRNA的3’poly A尾和5’GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物；2）扣除組cDNA隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增制備扣除探針，同時(shí)摻入生物素；3）實(shí)驗(yàn)組cDNA與扣除探針雜交，除去雜交體及未雜交上的扣除探針，得到實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的cDNA，然后用錨定引物擴(kuò)增并克隆。（SSH）：1）具體過程：第一階段：與RDA法類似，用識別4堿基的限制酶(如Hae Ⅲ 等)消化實(shí)驗(yàn)組(Tester)與驅(qū)動組(Driver)cDNA ,得到平末端cDNA短片段；第二階段： 實(shí)驗(yàn)組cDNA均分為兩份,分別加接頭1和接頭2，各自與過量的驅(qū)動組cDNA酶切片段雜交，雜交產(chǎn)物混合后再與驅(qū)動組新的cDNA酶切片段進(jìn)行第二輪雜交，產(chǎn)物補(bǔ)平后作為模板，加引物作2次PCR擴(kuò)增。：使用PCR以指數(shù)形式擴(kuò)增雙分子自鏈模板，以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使得目的基因片段得到特異性擴(kuò)增。(4)消減雜交技術(shù)。(2).基因表達(dá)的系統(tǒng)分析：；： 所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備少；一次可測得多個(gè)基因片段(3’部分序列)；可能獲得新的基因片段 。：靈敏度高，不需測序，操作時(shí)間短。：(1).基因芯片技術(shù)：，雜交信號陽性的探針序列即為細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列。E）.對蛋白質(zhì)序列中酶敏感區(qū)域改造。C）.共表達(dá)某些輔助因子提高目的蛋白穩(wěn)定性。3）提高外源蛋白的穩(wěn)定性：A）.利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)把目的蛋白積累在間周質(zhì)或分泌到胞外。：1）表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)與選擇：A）選擇適當(dāng)?shù)膹?qiáng)啟動子；B）引入原核增強(qiáng)子樣序列；C）.設(shè)計(jì)合理的SD序列；D）.外源基因中稀有密碼子的影響，解決辦法：堿基突變和共表達(dá)稀有密碼子的tRNA基因。：1）復(fù)制子； 2）篩選標(biāo)記 ； 3）啟動子和終止子； 4）核糖體結(jié)合位點(diǎn) ?？寺』蚺c啟動子之間有正確的讀框。4）外源基因下游應(yīng)加入不依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。2）顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記。2）大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：：大腸桿菌； ：大腸桿菌質(zhì)粒。表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在。：1）優(yōu)點(diǎn)：遺傳背景清楚、目的基因表達(dá)水平高、培養(yǎng)周期短。(5) .外源基因的大小(bp數(shù)): 注意某些病毒載體對外源基因的容量。(3). 篩選標(biāo)記的選擇。：啟動子；增強(qiáng)子；拼接信號；終止信號和多聚腺苷酸化信號；篩選標(biāo)記(多為藥物選擇標(biāo)記基因)；報(bào)告基因；表位標(biāo)簽；真核病毒序列： (1). 表達(dá)蛋白質(zhì)的目的: 研究啟動子和調(diào)控元件所選的報(bào)告基因載體的組成不同，前者的載體不含啟動子，后者則相反。(4).原核細(xì)胞缺乏蛋白質(zhì)翻譯后加工的能力；若要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要糖基化及高級結(jié)構(gòu)，應(yīng)采用真核表達(dá)系統(tǒng)。(2).原核表達(dá)載體的mRNA有SD序列，真核細(xì)胞無。(3)克隆基因與啟動子之間有正確的讀框。：(1)有一個(gè)強(qiáng)啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列。 2）Poly(A)尾的作用：延長mRNA的半衰期限； 促進(jìn)翻譯效率。反式作用因子的作用模式：扭曲、滑動、成環(huán)等4）中介因子對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控5）多重增強(qiáng)子作用：金屬硫蛋白基因；組合式基因調(diào)控。 少數(shù)：先結(jié)合后激活。 共價(jià)修飾: 作用時(shí)間較長，常見有磷酸化/去磷酸化、糖基化，都作用于Ser和Thr，有競爭排斥； 配體結(jié)合：如激素受體類反式作用因子，只有當(dāng)與激素結(jié)合才有活性；蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用：如堿性亮氨酸拉鏈的二異聚體化。：要通過調(diào)節(jié)反式作用因子的活性控制轉(zhuǎn)錄起始。轉(zhuǎn)錄因子之間不同方案組合，生成有活性、專一性的復(fù)合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結(jié)合、轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的基因。Ⅱ（轉(zhuǎn)錄因子）參與RNApol Ⅱ轉(zhuǎn)錄：1）TF ⅡD：辨認(rèn)TATA盒； 2）TF ⅡA：穩(wěn)定TF ⅡD結(jié)合； 3）TF ⅡB：促進(jìn)pol Ⅱ結(jié)合； 4）TF ⅡF：解旋酶； 5）TF ⅡE：ATPase。：1）一般具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA識別結(jié)構(gòu)域（鋅指、堿性α螺旋、堿性亮氨酸拉鏈、堿性螺旋環(huán)螺旋）、轉(zhuǎn)錄激活域（酸性激活域、谷氨酰胺富含域、脯氨酸富含域）和蛋白質(zhì)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域（二聚化結(jié)構(gòu)域）；2）能識別并結(jié)合調(diào)控區(qū)的順式作用元件；3）對基因表達(dá)有正性調(diào)節(jié)（激活）和負(fù)性調(diào)節(jié)（抑制）二種方式。 作用機(jī)制：可能通過與某些調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用。3）增強(qiáng)子：能增強(qiáng)啟動子活性的DNA序列。2）上游啟動子元件：一些位于TATA盒上游的可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄DNA序列。C：選用BACToBACR Baculovirus Expression System：先通過將目的基因克隆到供體質(zhì)粒pFastBac1上并轉(zhuǎn)化入含助手質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體的感受態(tài)大腸桿菌中，獲得重組病毒顆粒后感染入昆蟲細(xì)胞。 2）桿狀病毒表達(dá)載體和桿狀病毒共轉(zhuǎn)染方法：A：用重組轉(zhuǎn)移載體與野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞而得到重組桿狀病毒。1）1. 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體結(jié)構(gòu)：多數(shù)載體由pUC質(zhì)粒改造而來，含ampr基因。：桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS) 包括桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒(野生型或變異型)。：①整合型質(zhì)粒； ②附加體質(zhì)粒； ③復(fù)制型質(zhì)粒； ④著絲粒質(zhì)粒； ⑤酵母人工染色體：（一）、酵母細(xì)胞表達(dá)載體； （二）、酵母細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：1）酵母細(xì)胞培養(yǎng)； 細(xì)胞密度測定； 酵母細(xì)胞株的保存；2）酵母質(zhì)粒的提?。?）外源基因?qū)虢湍讣?xì)胞。5 ）.外源基因的大小: 注意載體對外源基因的容量要求。2）. 附加物的選取: 附加物有表位標(biāo)簽{如(His)GST}、GFP等。：1）質(zhì)粒型載體，組成：啟動子，增強(qiáng)子，多聚腺苷酸化信號：穩(wěn)定mRNA，保證基因表達(dá)的效率，篩選標(biāo)記(多為藥物選擇標(biāo)記基因)，報(bào)告基因，表位標(biāo)簽； 2）病毒型載體：將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞或替換哺乳動物細(xì)胞中的缺陷基因。:1)病毒感染。：1）基因分析：（一）基因缺失的檢測；（二）基因突變的檢測；（三）基因易位的檢測；（四）外源致病基因的檢測；2）定位克?。?）序列分析。底物dNTP濃度；4。Taq聚合酶的性能；2。端不要終止于密碼子的第3位。端限定PCR產(chǎn)物