【正文】 能分辨100個點.計算機圖象分析和大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù) 主要是依賴于計算機和數(shù)據(jù)庫信息對二維凝膠電泳分離得到的圖譜上的蛋白質(zhì)進行定位,定量,圖譜比較,差異點尋找等.生物質(zhì)譜技術(shù) 原理:生物質(zhì)譜技術(shù)是把生物大分子離子化后, 根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比(M/Z) 的差異來分離并確定相對分子質(zhì)量的一類技術(shù).肽指紋圖譜的原理 將蛋白質(zhì)經(jīng)酶切之后,形成長短不一的肽段,通過質(zhì)譜儀檢測就可得到所有肽段的分子量,從而形成不同質(zhì)量的肽段質(zhì)量圖,就是肽指紋圖譜(peptide mass finger printing, PMF)對于相同的蛋白質(zhì)來說, PMF應該是一定的,因此可特異的檢測樣品中的未知蛋白質(zhì).第十八章 生物信息學生物信息學是一門交叉科學，它包含了生物信息的獲取、處理、存儲、分發(fā)、分析和解釋等在內(nèi)的所有方面，它綜合運用數(shù)學、計算機科學和生物學的各種工具，來闡明和理解大量數(shù)據(jù)所包含的生物學意義。由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質(zhì)的SDS復合物都帶有幾乎相同密度的負電荷，大大超過了蛋白質(zhì)分子原有所帶的負電荷，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)電荷之間的差別。當在凝膠加入一定量的SDS, 就構(gòu)成了SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)。 *蛋白質(zhì)的等電點(isoelectric point,pI) 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)組學是在整體水平上研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的科學.三大基本支撐技術(shù) 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)2DE又稱雙向電泳原理: 是根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個一級屬性：等電點和分子量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物在電荷和分子量兩個水平上進行分離。 后基因組學(postgenomics)是在完成基因組圖譜構(gòu)建以及全部序列測定的基礎(chǔ)上，進一步研究全基因組的基因功能、基因之間的相互關(guān)系和調(diào)控機制為主要內(nèi)容的學科。帶正電荷粒子最先流出；中性粒子的電泳速度為“零”，故其遷移速度相當于EOF速度；帶負電荷粒子運動方向與EOF方向相反，因EOF速度一般大于電泳速度，故它將在中性粒子之后流出；各種粒子因遷移速度不同而實現(xiàn)分離。CE所用的石英毛細管在pH＞3時，硅醇基離子化，其內(nèi)表面帶負電，和溶液接觸形成一雙電層．在高電壓作用下，雙電層中的水合陽離子層引起溶液在毛細管內(nèi)整體向負極流動，形成電滲流。 用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子。相對較小的分子在電場轉(zhuǎn)換后可以較快轉(zhuǎn)變移動方向，而較大的分子在凝膠中轉(zhuǎn)向較為困難。將人類基因組DNA分段克隆, 然后逐段進行序列分析, 在按標志將各重疊片段拼接, 構(gòu)成完整的基因組DNA序列圖. 結(jié)構(gòu)基因組學研究的常用技術(shù)脈沖場凝膠電泳 (pulsed field gel electrophoresis, PFGE)原理:在凝膠電泳中，電場不斷地改變方向。轉(zhuǎn)錄圖譜：是指轉(zhuǎn)錄體(RNAs)或其反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA在基因組中的位置, 又稱基因圖譜或表達圖譜(expression map)；是根據(jù)組織細胞中可表達片段標簽(expressed sequence tags, EST)繪制的圖譜；是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA或EST的部分cDNA片段作為“探針”與基因組DNA進行分子雜交, 標記轉(zhuǎn)錄基因, 繪制出可表達基因的轉(zhuǎn)錄圖。這些技術(shù)是以遺傳連鎖為基礎(chǔ)的所以也稱連鎖圖譜（linkage map)基因定位:根據(jù)重組值確定不同基因在染色體上的相對位置和排列順序.物理圖譜：全基因組DNA經(jīng)各種限制性內(nèi)切酶切割后，將各酶切片段按其原有順序重新拼接而成。 主要目的： 是建立高分辨的遺傳、物理、轉(zhuǎn)錄和和DNA序列等圖譜.功能基因組學:認識、分析整個基因組所包含的基因、非基因序列及其功能.比較基因組學:比較不同物種的整個基因組，增強對各個基因組功能及發(fā)育相關(guān)性的認識.遺傳圖譜 (genetic map) 是利用人類基因組中的一些特殊位點作為遺傳標志而進行的基因組分區(qū)。第十六章 基因組學基因組：泛指一個有生命體、病毒或細胞器的全部遺傳物質(zhì),包括基因和基因間區(qū)域.包括:原核生物基因組 真核生物基因組 病毒基因組 基因組學定義 就是發(fā)展和應用DNA制圖、測序新技術(shù)以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結(jié)構(gòu)和功能。(4)穿透能力強: RNAi能在不同的細胞間長距離傳遞(5) 穩(wěn)定性高:此機制可能是siRNA與某種保護性蛋白結(jié)合,從而使其具有相對的穩(wěn)定性。 RNAi 的作用特點(1)“共抑制”: RNAi 使外源基因同源的內(nèi)源基因沉默 2)效率高: 效率比單純反義或正義RNA 的抑制效率高100fold, 使靶基因表達降到很低水平甚至完全“剔除” (knockdown) 。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。在細胞內(nèi),雙鏈RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的參與下被處理為21個～23個堿基的小RNA，即小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合物(RNAinduced silencing plex，RISC)。RNA干擾(RNA interference，RNAi) ，當細胞中導入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)時，誘導該同源mRNA發(fā)生降解而導致該基因表達沉默的現(xiàn)象。以四種方式發(fā)揮生物學功能：異體催化剪切、自體催化剪切、第一組內(nèi)含子和第二組 內(nèi)含子自我剪切。 有較好的穩(wěn)定性，具有廣泛的藥用價值。 可分成三類：① 作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA直接結(jié)合，抑制翻譯； ② 與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，抑制翻譯；③ 作用于基因的啟動子，抑制轉(zhuǎn)錄。基因沉默技術(shù)的目的是對具有特定序列的基因表達進行特異的抑制。DNA芯片是指通過微加工技術(shù)將大量的DNA以預先設計的排列方式有序地固定在載體表面，形成儲存有大量信息的DNA陣列。因此，測定時，若以待測DNA片段為模板，在DNA聚合酶、引物、dNTP（其中一種用32P/35S標記）存在下，分別加入ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP進行復制反應，反應結(jié)束后，即可得到一系列分別以ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP為結(jié)尾但長度不同的DNA片段。3. 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。PCR產(chǎn)物片段的大小應與預計的一致。標準的PCR反應體系： Total volume 100ul(20100ul) 10擴增緩沖液 　 10ul　　　4種dNTP混合物 　 各200umol/L引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 ～2ug　Taq DNA聚合酶 　 　　　 Mg2+　　　　　　 　 100ulPCR擴增產(chǎn)物的分析 PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增 ，其結(jié)果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定。 PCR反應五要素：(1).引物；(2).酶；(3).dNTP；(4).模板；(5).Mg2+。PCR由變性退火延伸三個基本反應步驟構(gòu)成： 1): 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右后，雙鏈DNA變性為單鏈DNA ； 2): 模板DNA與引物的退火(復性)：溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； 3): 引物的延伸：DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈， 重復循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 Western印跡雜交：是一種蛋白質(zhì)印跡雜交，是將待測蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)移到固相支持物上與探針即待測蛋白質(zhì)的相應的抗體或抗原雜交的實驗技術(shù)。Southern 印跡雜交DNA + DNA雜交: 即將待測DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)移（?。┎⒐潭ㄔ诠滔嘀С治锷?，用已知DNA探針進行檢測的方法。若不知核酸序列，可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序，但要考慮到密碼子的兼并性。容易降解。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）無內(nèi)含子和非編碼序列。DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。復性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復。核酸分子雜交： 是在DNA變性和復性的基礎(chǔ)上建立起來的一種分子生物學技術(shù). 其原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補的原則可以形成雙鏈(堿基對之間非共價健形成穩(wěn)定的雙鏈). DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團樣DNA，稱為DNA變性。連續(xù)凝膠電泳：指整個電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的。電滲現(xiàn)象：液體在電場中對于一個固體支持物的相對移動。聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱PAGE）： 是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法 電泳：是指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。 溫度每升高1℃，%。 液體在電場中對于一個固體支持物的相對移動，稱為電滲現(xiàn)象。電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。 顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場中泳動速度快，反之則泳動速度慢。因此，可在同一凝膠中、一定電腸強度下可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。 基因治療的基本程序：目的基因的選擇與獲得；載體的選擇；將目的基因克隆到載體； 應用物理、化學或生物學等技術(shù)和方法將外源目的基因（可以是基因的DNA片段或序列）轉(zhuǎn)移到受體菌或者細胞內(nèi)，并在細菌或細胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴增和表達，稱為基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。旁觀者效應:“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。 RNA干涉（RNA interference， RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。該酶可以切割DNA 反義RNA(antisense RNA):是指與mRNA互補的RNA分子,通常由1520個核苷酸組成 。2基因干預(gene interference)：指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的。這是目前基因治療大多采用的方法，對單拷貝基因遺傳病有效。直接基因治療和間接基因治療 直接基因治療(致病基因的原位置換)：糾正突變基因，在原位修復缺陷的基因，以達到治療目的，為較理想的基因治療策略。 基因治療：指應用DNA重組技術(shù)，將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療的目的。分析發(fā)現(xiàn)， DNA 指紋圖譜中幾乎每一條帶紋都能在其雙親之一的圖譜中找到，這種帶紋符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律，即雙方的特征平均傳遞 50 ％ 給子代。熒光信號伴隨 PCR 產(chǎn)物的增長而增長目前用于臨床檢測的病原體基因診斷試劑絕大部分是此類。此時檢測不到熒光信號。探針的 3‘ 羥基（ OH ）已被去除或封閉，不具有延伸能力。 Normal βΑGene Probe——與正常βΑ雜交穩(wěn)定 Mutation βS Gene Probe——與異常βS雜交穩(wěn)定病原體基因診斷的主要技術(shù)方法 實時熒光定量 PCR （ Real Time Flourescence quantitative PCR, FQ—PCR ） 實時熒光定量 PCR在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上，添加了一條標記 2 個熒光基團的熒光雙標記探針。