【正文】 不能轉(zhuǎn)入胞核。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。即靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過相互作用激活報(bào)告基因的表達(dá)。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。(2)有多克隆位點(diǎn)(多種酶單一位點(diǎn))，易于外源DNA分子與載體及重組。：① l噬菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是l噬菌體生長(zhǎng)所非必需的。催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。2）C文庫(kù)構(gòu)建方法：反轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。3）人工接頭法：用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點(diǎn)。 實(shí)質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過程。(6).對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷。(2)隨機(jī)引物標(biāo)記法。生物素探針的檢測(cè)體系：①生物素探針+抗生物素蛋白+帶ALP或HRP的生物素+底物；②生物素探針+抗生物素抗體+ 抗生物素抗體的抗體+ABC試劑(底物:BCIP+NBT)。5 39。不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C；3）避免兩引物間的互補(bǔ),特別是3 39。Taq聚合酶的性能；2。：1）質(zhì)粒型載體，組成：?jiǎn)?dòng)子，增強(qiáng)子，多聚腺苷酸化信號(hào)：穩(wěn)定mRNA，保證基因表達(dá)的效率，篩選標(biāo)記(多為藥物選擇標(biāo)記基因)，報(bào)告基因，表位標(biāo)簽； 2）病毒型載體：將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞或替換哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的缺陷基因。：桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS) 包括桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒(野生型或變異型)。2）上游啟動(dòng)子元件：一些位于TATA盒上游的可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄DNA序列。Ⅱ（轉(zhuǎn)錄因子）參與RNApol Ⅱ轉(zhuǎn)錄：1）TF ⅡD：辨認(rèn)TATA盒； 2）TF ⅡA：穩(wěn)定TF ⅡD結(jié)合； 3）TF ⅡB：促進(jìn)pol Ⅱ結(jié)合； 4）TF ⅡF：解旋酶； 5）TF ⅡE：ATPase。 少數(shù)：先結(jié)合后激活。(3)克隆基因與啟動(dòng)子之間有正確的讀框。(3). 篩選標(biāo)記的選擇。2）大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)成：：大腸桿菌； ：大腸桿菌質(zhì)粒。：1）復(fù)制子； 2）篩選標(biāo)記 ； 3）啟動(dòng)子和終止子； 4）核糖體結(jié)合位點(diǎn) 。E）.對(duì)蛋白質(zhì)序列中酶敏感區(qū)域改造。(4)消減雜交技術(shù)。 芯片技術(shù)或稱DNA微陣列技術(shù)：1）為一項(xiàng) 高密度集成探針的雜交技術(shù)。利用該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。 影響結(jié)果的因素頗多。9. α 地中海貧血：1）α地中海貧血(αthalassemia,簡(jiǎn)稱α地貧)。缺失2個(gè) a 基因，間或有輕度貧血，我國(guó)主要是a 0地貧雜合子。載體的選擇224。目前此類方法常用。顯然, 當(dāng)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)入neo基因后，就會(huì)在含G418的選擇性培養(yǎng)基中存活，而未轉(zhuǎn)入neo基因的細(xì)胞則不能生存。1）能進(jìn)行分子內(nèi)自我催化的RNA片段不很長(zhǎng)，通常為60個(gè)核苷酸左右?；剌敾純后w內(nèi)224。:(1)探針的設(shè)計(jì)與芯片的制作：設(shè)計(jì)，制備，玻片的多聚L賴氨酸預(yù)處理，探針的打印與固化。脫保護(hù)，偶聯(lián)第二個(gè)核苷酸(如dCMP)224。5）空間位阻效應(yīng)：探針224。降解模板(總RNA或mRNA ) 224。擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞224。3）MAPK是多條信號(hào)通路的交匯點(diǎn),與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡有關(guān)。3）α亞基可結(jié)合GTP或GDP,并有GTP酶活性,αGTP可活化下游信號(hào)分子,βγ亞基是調(diào)節(jié)亞基。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)換信號(hào)的方式又分為三大類：離子通道受體，G蛋白偶聯(lián)受體和單跨膜受體。Ｇ蛋白224。 3）PKC的生理功能：① 調(diào)節(jié)代謝活化的PKC引起一系列靶蛋白的絲 、蘇氨酸殘基磷酸化。3）TPK在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等過程起重要的調(diào)節(jié)作用，并與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系。：1）受體型TPKRasMAPK途徑組成：催化性受體，GRB2, SOS, Ras蛋白, Raf蛋白，MAPK系統(tǒng)。+－依賴性蛋白激酶途徑：1）Ca2+－ 磷脂依賴性蛋白激酶途徑組成:胞外信息分子，G蛋白，磷脂酶C (PLC)，甘油二酯 (DAG)，三磷酸肌醇(IP3 )，蛋白激酶C (PKC)。 2）信息傳遞：激素224。 PI（5）P2———PI（5）P3 。2）異三聚體G protein由三個(gè)亞基α,β,γ組成。：1）受Ca2+ 和二?；视停―AG）激活；2）參與細(xì)胞多項(xiàng)生理活動(dòng)。十二、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：：① 通過相鄰細(xì)胞直接接觸（直接通訊）：A）.間隙連由連接蛋白形成,允許小分子和離子通過；B）.細(xì)胞表面分子 互相識(shí)別、粘附介導(dǎo)的通訊；C）.突觸連接 介導(dǎo)的通訊(神經(jīng)系統(tǒng))；② 通過細(xì)胞分泌各種化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞的代謝和功能（間接通訊)：內(nèi)分泌信號(hào)；旁分泌信號(hào)；自分泌信號(hào)。 討論：若用Cy3dCTP或Cy5dCTP(分別標(biāo)記2種樣品)，則應(yīng)相應(yīng)調(diào)整其余3種dNTP的濃度。3）雜交反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：呈線性關(guān)系。 加入單核苷酸(如dTMP)的亞磷酰胺活化端與活性羥基(OH)發(fā) 生化學(xué)偶聯(lián) ,光敏保護(hù)非活化端224。4）受專利保護(hù)。導(dǎo)入生長(zhǎng)、分裂的細(xì)胞224。技術(shù)方法：反義核酸技術(shù)；反義核酸核酶技術(shù)；細(xì)胞內(nèi)抗體( intrabody )技術(shù) 等等?；蚪M分為3個(gè)區(qū)：第1個(gè)區(qū)為L(zhǎng)TR(含增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào))；第2個(gè)區(qū)為ψ序列 (其編碼產(chǎn)物能有效包裝病毒基因組進(jìn)入病毒顆粒)；第3個(gè)區(qū)含3個(gè)結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env)。特點(diǎn)：離體培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因后回輸至患者體內(nèi)。：目的基因的選擇與制備224。患者只能合成少量a鏈， β 鏈形成 β 四聚體(β 4)，易被氧化，解聚成游離的單鏈，并積聚成包涵體，附著于紅細(xì)胞膜并使之受損，失去柔韌性，易被脾臟破壞，導(dǎo)致中度或較嚴(yán)重的溶血性貧血，稱為血紅蛋白 H病 ( Hb H disease )。：1）中等長(zhǎng)度 ()的DNA片段缺失或插入，可用一對(duì)引物的普通PCR檢測(cè),根據(jù)結(jié)果作出判斷。 缺點(diǎn) ：準(zhǔn)確性不如DNA測(cè)序。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。：1）分別將實(shí)驗(yàn)組和扣除組的mRNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)組利用mRNA的3’poly A尾和5’GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物；2）扣除組cDNA隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增制備扣除探針，同時(shí)摻入生物素；3）實(shí)驗(yàn)組cDNA與扣除探針雜交，除去雜交體及未雜交上的扣除探針，得到實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有的cDNA，然后用錨定引物擴(kuò)增并克隆。(2).基因表達(dá)的系統(tǒng)分析：；： 所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備少；一次可測(cè)得多個(gè)基因片段(3’部分序列)；可能獲得新的基因片段 。C）.共表達(dá)某些輔助因子提高目的蛋白穩(wěn)定性?？寺』蚺c啟動(dòng)子之間有正確的讀框。表達(dá)的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在。：?jiǎn)?dòng)子；增強(qiáng)子；拼接信號(hào)；終止信號(hào)和多聚腺苷酸化信號(hào)；篩選標(biāo)記(多為藥物選擇標(biāo)記基因)；報(bào)告基因；表位標(biāo)簽；真核病毒序列： (1). 表達(dá)蛋白質(zhì)的目的: 研究啟動(dòng)子和調(diào)控元件所選的報(bào)告基因載體的組成不同，前者的載體不含啟動(dòng)子，后者則相反。：(1)有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子及其兩側(cè)的調(diào)控序列。 共價(jià)修飾: 作用時(shí)間較長(zhǎng)，常見有磷酸化/去磷酸化、糖基化，都作用于Ser和Thr，有競(jìng)爭(zhēng)排斥； 配體結(jié)合：如激素受體類反式作用因子，只有當(dāng)與激素結(jié)合才有活性；蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用：如堿性亮氨酸拉鏈的二異聚體化。：1）一般具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域（鋅指、堿性α螺旋、堿性亮氨酸拉鏈、堿性螺旋環(huán)螺旋）、轉(zhuǎn)錄激活域（酸性激活域、谷氨酰胺富含域、脯氨酸富含域）和蛋白質(zhì)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域（二聚化結(jié)構(gòu)域）；2）能識(shí)別并結(jié)合調(diào)控區(qū)的順式作用元件；3）對(duì)基因表達(dá)有正性調(diào)節(jié)（激活）和負(fù)性調(diào)節(jié)（抑制）二種方式。C：選用BACToBACR Baculovirus Expression System：先通過將目的基因克隆到供體質(zhì)粒pFastBac1上并轉(zhuǎn)化入含助手質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體的感受態(tài)大腸桿菌中，獲得重組病毒顆粒后感染入昆蟲細(xì)胞。：①整合型質(zhì)粒； ②附加體質(zhì)粒； ③復(fù)制型質(zhì)粒； ④著絲粒質(zhì)粒； ⑤酵母人工染色體：（一）、酵母細(xì)胞表達(dá)載體； （二）、酵母細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：1）酵母細(xì)胞培養(yǎng)； 細(xì)胞密度測(cè)定； 酵母細(xì)胞株的保存；2）酵母質(zhì)粒的提取；3）外源基因?qū)虢湍讣?xì)胞。:1)病毒感染。端不要終止于密碼子的第3位。 配制時(shí)注意:① 由于引物呈很輕的干膜狀附在管壁上,打開時(shí)極易散失, 故打開管子前要先離心, 再慢慢打開,溶解時(shí)加足量水后蓋蓋,充分上下振蕩5～10min② 溶解后分裝, 凍存于20℃；2） PCR反應(yīng)緩沖液：TrisCl（pH ～)； KCl或(NH4)2SO4:促使引物退火； MgCl2:影響酶活與精確度,產(chǎn)物的特異性； 明膠或BSA或Tween20:穩(wěn)定酶活性； 甲酰胺:使引物與模板特異性配對(duì)；3）耐熱DNA聚合酶；4）dNTP：常用濃度是20～200μmol/L；避免反復(fù)凍融, 分裝凍存于20℃；5）模板DNA：抽提方法：簡(jiǎn)單的水煮沸法，去垢劑裂解細(xì)胞→蛋白酶消化蛋白→有機(jī)溶劑抽提→乙醇沉淀核酸。(2)．單鏈DNA模板與引物退火 (annealing)：引物與模板形成復(fù)合物的幾率DNA分子自身的復(fù)性?！淠┒藰?biāo)記，為加磷酸反應(yīng)，而且要讓p/32P進(jìn)入5′末端，故應(yīng)選擇[γ32P]ATP， 150μci/反應(yīng)。 非放射性標(biāo)記物：1）生物素；2）地高辛；3）熒光素：FITC，羅丹明。(4).檢測(cè)方法具有高度特異性。 Southern印跡雜交：堿變性: 用一已知的DNA或RNA片段(探針)來(lái)檢測(cè)樣品中未知的核苷酸序列，通過核苷酸間堿基互補(bǔ)的原理互相結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置和大小顯示出來(lái)。 缺陷：高背景(自身環(huán)化)；雙向(正、反)插入；多拷貝插入。 用途：1. 在連接反應(yīng)中去除載體DNA片段5′P，防止載體自我連接. 2. 用32P標(biāo)記5′末端時(shí)，用此酶去除5′P，再用激酶進(jìn)行5′的 32P標(biāo)記.：1）基因組文庫(kù)(G文庫(kù))用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的DNA重組分子中的集合, 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列； 2）G文庫(kù)構(gòu)建方法：鳥槍法； 3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)。用途：1）隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針主要用途；2）雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序；3）cDNA第二鏈的合成；4）DNA 3′突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記(DNA ligase)——基因工程的縫紉針：催化雙鏈DNA相鄰堿基5′P和3′OH間磷酸二酯鍵形成的酶。：1）分子相對(duì)較小，具有較高的拷貝數(shù)； 2）含高效的復(fù)制子，可用氯霉素阻止細(xì)菌蛋白 質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加；3）具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因或營(yíng)養(yǎng)代謝基因等。六、DNA重組\雜交1. DNA重組技術(shù)基本程序：外源DNA的獲取克隆載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的連接 DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達(dá) ：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。在這系統(tǒng)中，野生型BDX/ADY間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNABD與Gal4的AD靠近, 形成復(fù)合物，激活報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。(4)有時(shí)DNABD或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。2）轉(zhuǎn)化效率偏低：辦法：引進(jìn)酵母接合型3）陰性干擾：兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報(bào)告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來(lái)許多假陽(yáng)性。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。(3)簡(jiǎn)潔性。 (3)通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。：轉(zhuǎn)錄激活因子上有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。 藥品不純。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的；2）在分配層析柱中，物質(zhì)只有橫向擴(kuò)散，沒有縱向擴(kuò)散，而且在兩相間達(dá)到分配平衡的速度很快；3）體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。 ：必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?：1）利用溶解度的差異分離：。由于電泳基質(zhì)的上述四個(gè)不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時(shí)得以濃縮，然后再被分離。(4)溶液的離子強(qiáng)度：影響電動(dòng)電位，緩沖液離子強(qiáng) 度越高，電動(dòng)電位越小，泳動(dòng)速度慢。：除分子伴侶和折疊酶外；還與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)（形成轉(zhuǎn)角的殘基數(shù)目及平均帶電性等）和生長(zhǎng)條件（宿主、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基和pH等）有關(guān)。 注意事項(xiàng)：與Lowry相比，采用BCA法時(shí)，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值；為促進(jìn)BCA法的反應(yīng)進(jìn)程，可將樣品適當(dāng)加熱。 注意事項(xiàng)： ug～15 ug BSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系；反應(yīng)10～15 min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀；若選用目的蛋白來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線或用另一種方法來(lái)校正，所測(cè)蛋白濃度較準(zhǔn)確。CDK1使底物蛋白磷酸化224。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。2）病毒感染抑制細(xì)胞凋亡：許多病毒具有抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，有利于建立持續(xù)感染、延長(zhǎng)病毒復(fù)制時(shí)間、以最大限度產(chǎn)生子代病毒。主要方法有2種: 1）. TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介導(dǎo)的原位的缺口平移(ISNT)。(3)Bcl2蛋白具抗氧化作用。(4)粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：CrB由CTL分泌進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿后,，切割胞漿和核中的多種底物；Caspase依賴的死亡通路是CrB介導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要途徑之一。 CDA游離并進(jìn)入核內(nèi)降解DNA,）剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白：如Caspase對(duì)核板的降解作用。 DNA多態(tài)性標(biāo)記的價(jià)值：1）為路標(biāo)，構(gòu)建DNA標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜?？寺』蚨ㄎ环ǎ辉浑s交法；原位PCR；定位克隆技術(shù)。（六 ）功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族：1）編碼某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等。(3). 序列保守性。:（一）分子量很大的DNA與蛋白質(zhì)形成染色體存在于