【正文】 不能轉(zhuǎn)入胞核。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。即靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點之間通過相互作用激活報告基因的表達。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。(2)有多克隆位點(多種酶單一位點)，易于外源DNA分子與載體及重組。：① l噬菌體生長繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是l噬菌體生長所非必需的。催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。2）C文庫構(gòu)建方法：反轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導入宿主細胞而形成。3）人工接頭法：用于在質(zhì)粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。 實質(zhì)是核酸分子的變性與復性過程。(6).對環(huán)境無污染，對人體無損傷。(2)隨機引物標記法。生物素探針的檢測體系：①生物素探針+抗生物素蛋白+帶ALP或HRP的生物素+底物；②生物素探針+抗生物素抗體+ 抗生物素抗體的抗體+ABC試劑(底物:BCIP+NBT)。5 39。不應有連續(xù)3個G或C；3）避免兩引物間的互補,特別是3 39。Taq聚合酶的性能；2。：1）質(zhì)粒型載體，組成：啟動子，增強子，多聚腺苷酸化信號：穩(wěn)定mRNA，保證基因表達的效率，篩選標記(多為藥物選擇標記基因)，報告基因，表位標簽； 2）病毒型載體：將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎蛱鎿Q哺乳動物細胞中的缺陷基因。：桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(BEVS) 包括桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒(野生型或變異型)。2）上游啟動子元件：一些位于TATA盒上游的可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄DNA序列。Ⅱ（轉(zhuǎn)錄因子）參與RNApol Ⅱ轉(zhuǎn)錄：1）TF ⅡD：辨認TATA盒； 2）TF ⅡA：穩(wěn)定TF ⅡD結(jié)合； 3）TF ⅡB：促進pol Ⅱ結(jié)合； 4）TF ⅡF：解旋酶； 5）TF ⅡE：ATPase。 少數(shù)：先結(jié)合后激活。(3)克隆基因與啟動子之間有正確的讀框。(3). 篩選標記的選擇。2）大腸桿菌表達載體的構(gòu)成：：大腸桿菌； ：大腸桿菌質(zhì)粒。：1）復制子； 2）篩選標記 ； 3）啟動子和終止子； 4）核糖體結(jié)合位點 。E）.對蛋白質(zhì)序列中酶敏感區(qū)域改造。(4)消減雜交技術(shù)。 芯片技術(shù)或稱DNA微陣列技術(shù)：1）為一項 高密度集成探針的雜交技術(shù)。利用該法可檢測細胞內(nèi)病毒感染、細胞內(nèi)基因重排、以及分析細胞內(nèi)RNA表達產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。 影響結(jié)果的因素頗多。9. α 地中海貧血：1）α地中海貧血(αthalassemia,簡稱α地貧)。缺失2個 a 基因，間或有輕度貧血，我國主要是a 0地貧雜合子。載體的選擇224。目前此類方法常用。顯然, 當真核細胞轉(zhuǎn)入neo基因后，就會在含G418的選擇性培養(yǎng)基中存活，而未轉(zhuǎn)入neo基因的細胞則不能生存。1）能進行分子內(nèi)自我催化的RNA片段不很長，通常為60個核苷酸左右?；剌敾純后w內(nèi)224。:(1)探針的設計與芯片的制作：設計，制備，玻片的多聚L賴氨酸預處理，探針的打印與固化。脫保護，偶聯(lián)第二個核苷酸(如dCMP)224。5）空間位阻效應：探針224。降解模板(總RNA或mRNA ) 224。擴散或血循環(huán)到達靶細胞224。3）MAPK是多條信號通路的交匯點,與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、凋亡有關(guān)。3）α亞基可結(jié)合GTP或GDP,并有GTP酶活性,αGTP可活化下游信號分子,βγ亞基是調(diào)節(jié)亞基。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)換信號的方式又分為三大類：離子通道受體，G蛋白偶聯(lián)受體和單跨膜受體。Ｇ蛋白224。 3）PKC的生理功能：① 調(diào)節(jié)代謝活化的PKC引起一系列靶蛋白的絲 、蘇氨酸殘基磷酸化。3）TPK在細胞的生長、增殖、分化等過程起重要的調(diào)節(jié)作用，并與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系。：1）受體型TPKRasMAPK途徑組成：催化性受體，GRB2, SOS, Ras蛋白, Raf蛋白，MAPK系統(tǒng)。+－依賴性蛋白激酶途徑：1）Ca2+－ 磷脂依賴性蛋白激酶途徑組成:胞外信息分子，G蛋白，磷脂酶C (PLC)，甘油二酯 (DAG)，三磷酸肌醇(IP3 )，蛋白激酶C (PKC)。 2）信息傳遞：激素224。 PI（5）P2———PI（5）P3 。2）異三聚體G protein由三個亞基α,β,γ組成。：1）受Ca2+ 和二?；视停―AG）激活；2）參與細胞多項生理活動。十二、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路：：① 通過相鄰細胞直接接觸（直接通訊）：A）.間隙連由連接蛋白形成,允許小分子和離子通過；B）.細胞表面分子 互相識別、粘附介導的通訊；C）.突觸連接 介導的通訊(神經(jīng)系統(tǒng))；② 通過細胞分泌各種化學物質(zhì)調(diào)節(jié)其他細胞的代謝和功能（間接通訊)：內(nèi)分泌信號；旁分泌信號；自分泌信號。 討論：若用Cy3dCTP或Cy5dCTP(分別標記2種樣品)，則應相應調(diào)整其余3種dNTP的濃度。3）雜交反應動力學：呈線性關(guān)系。 加入單核苷酸(如dTMP)的亞磷酰胺活化端與活性羥基(OH)發(fā) 生化學偶聯(lián) ,光敏保護非活化端224。4）受專利保護。導入生長、分裂的細胞224。技術(shù)方法：反義核酸技術(shù)；反義核酸核酶技術(shù)；細胞內(nèi)抗體( intrabody )技術(shù) 等等?；蚪M分為3個區(qū)：第1個區(qū)為LTR(含增強子、啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和終止信號)；第2個區(qū)為ψ序列 (其編碼產(chǎn)物能有效包裝病毒基因組進入病毒顆粒)；第3個區(qū)含3個結(jié)構(gòu)基因(gag、pol、env)。特點：離體培養(yǎng)細胞，轉(zhuǎn)基因后回輸至患者體內(nèi)。：目的基因的選擇與制備224。患者只能合成少量a鏈， β 鏈形成 β 四聚體(β 4)，易被氧化，解聚成游離的單鏈，并積聚成包涵體，附著于紅細胞膜并使之受損，失去柔韌性，易被脾臟破壞，導致中度或較嚴重的溶血性貧血，稱為血紅蛋白 H病 ( Hb H disease )。：1）中等長度 ()的DNA片段缺失或插入，可用一對引物的普通PCR檢測,根據(jù)結(jié)果作出判斷。 缺點 ：準確性不如DNA測序?？蛇M行細胞內(nèi)定位。：1）分別將實驗組和扣除組的mRNA反轉(zhuǎn)錄，實驗組利用mRNA的3’poly A尾和5’GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物；2）扣除組cDNA隨機引物PCR擴增制備扣除探針，同時摻入生物素；3）實驗組cDNA與扣除探針雜交，除去雜交體及未雜交上的扣除探針，得到實驗組獨有的cDNA，然后用錨定引物擴增并克隆。(2).基因表達的系統(tǒng)分析：；： 所需實驗設備少；一次可測得多個基因片段(3’部分序列)；可能獲得新的基因片段 。C）.共表達某些輔助因子提高目的蛋白穩(wěn)定性?？寺』蚺c啟動子之間有正確的讀框。表達的蛋白質(zhì)多以包含體形式存在。：啟動子；增強子；拼接信號；終止信號和多聚腺苷酸化信號；篩選標記(多為藥物選擇標記基因)；報告基因；表位標簽；真核病毒序列： (1). 表達蛋白質(zhì)的目的: 研究啟動子和調(diào)控元件所選的報告基因載體的組成不同，前者的載體不含啟動子，后者則相反。：(1)有一個強啟動子及其兩側(cè)的調(diào)控序列。 共價修飾: 作用時間較長，常見有磷酸化/去磷酸化、糖基化，都作用于Ser和Thr，有競爭排斥； 配體結(jié)合：如激素受體類反式作用因子，只有當與激素結(jié)合才有活性；蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用：如堿性亮氨酸拉鏈的二異聚體化。：1）一般具有三個結(jié)構(gòu)域：DNA識別結(jié)構(gòu)域（鋅指、堿性α螺旋、堿性亮氨酸拉鏈、堿性螺旋環(huán)螺旋）、轉(zhuǎn)錄激活域（酸性激活域、谷氨酰胺富含域、脯氨酸富含域）和蛋白質(zhì)蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域（二聚化結(jié)構(gòu)域）；2）能識別并結(jié)合調(diào)控區(qū)的順式作用元件；3）對基因表達有正性調(diào)節(jié)（激活）和負性調(diào)節(jié)（抑制）二種方式。C：選用BACToBACR Baculovirus Expression System：先通過將目的基因克隆到供體質(zhì)粒pFastBac1上并轉(zhuǎn)化入含助手質(zhì)粒和桿狀病毒穿梭載體的感受態(tài)大腸桿菌中，獲得重組病毒顆粒后感染入昆蟲細胞。：①整合型質(zhì)粒； ②附加體質(zhì)粒； ③復制型質(zhì)粒； ④著絲粒質(zhì)粒； ⑤酵母人工染色體：（一）、酵母細胞表達載體； （二）、酵母細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：1）酵母細胞培養(yǎng)； 細胞密度測定； 酵母細胞株的保存；2）酵母質(zhì)粒的提??；3）外源基因?qū)虢湍讣毎?1)病毒感染。端不要終止于密碼子的第3位。 配制時注意:① 由于引物呈很輕的干膜狀附在管壁上,打開時極易散失, 故打開管子前要先離心, 再慢慢打開,溶解時加足量水后蓋蓋,充分上下振蕩5～10min② 溶解后分裝, 凍存于20℃；2） PCR反應緩沖液：TrisCl（pH ～)； KCl或(NH4)2SO4:促使引物退火； MgCl2:影響酶活與精確度,產(chǎn)物的特異性； 明膠或BSA或Tween20:穩(wěn)定酶活性； 甲酰胺:使引物與模板特異性配對；3）耐熱DNA聚合酶；4）dNTP：常用濃度是20～200μmol/L；避免反復凍融, 分裝凍存于20℃；5）模板DNA：抽提方法：簡單的水煮沸法，去垢劑裂解細胞→蛋白酶消化蛋白→有機溶劑抽提→乙醇沉淀核酸。(2)．單鏈DNA模板與引物退火 (annealing)：引物與模板形成復合物的幾率DNA分子自身的復性?！淠┒藰擞?，為加磷酸反應，而且要讓p/32P進入5′末端，故應選擇[γ32P]ATP， 150μci/反應。 非放射性標記物：1）生物素；2）地高辛；3）熒光素：FITC，羅丹明。(4).檢測方法具有高度特異性。 Southern印跡雜交：堿變性: 用一已知的DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知的核苷酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原理互相結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置和大小顯示出來。 缺陷：高背景(自身環(huán)化)；雙向(正、反)插入；多拷貝插入。 用途：1. 在連接反應中去除載體DNA片段5′P，防止載體自我連接. 2. 用32P標記5′末端時，用此酶去除5′P，再用激酶進行5′的 32P標記.：1）基因組文庫(G文庫)用基因克隆的方法保存宿主細胞中的DNA重組分子中的集合, 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列； 2）G文庫構(gòu)建方法：鳥槍法； 3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)。用途：1）隨機引物標記法標記探針主要用途；2）雙脫氧末端終止法進行DNA測序；3）cDNA第二鏈的合成；4）DNA 3′突出末端進行末端標記(DNA ligase)——基因工程的縫紉針：催化雙鏈DNA相鄰堿基5′P和3′OH間磷酸二酯鍵形成的酶。：1）分子相對較小，具有較高的拷貝數(shù)； 2）含高效的復制子，可用氯霉素阻止細菌蛋白 質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加；3）具有多種遺傳選擇標記，包括各種抗藥基因或營養(yǎng)代謝基因等。六、DNA重組\雜交1. DNA重組技術(shù)基本程序：外源DNA的獲取克隆載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的連接 DNA導入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達 ：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。在這系統(tǒng)中，野生型BDX/ADY間的相互作用激活一種毒性標志作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。當兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNABD與Gal4的AD靠近, 形成復合物，激活報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。(4)有時DNABD或AD融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。2）轉(zhuǎn)化效率偏低：辦法：引進酵母接合型3）陰性干擾：兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。(3)簡潔性。 (3)通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。：轉(zhuǎn)錄激活因子上有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。 藥品不純。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的；2）在分配層析柱中，物質(zhì)只有橫向擴散，沒有縱向擴散，而且在兩相間達到分配平衡的速度很快；3）體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。 ：必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學組成選擇適當?shù)拿?：1）利用溶解度的差異分離：。由于電泳基質(zhì)的上述四個不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時得以濃縮，然后再被分離。(4)溶液的離子強度：影響電動電位，緩沖液離子強 度越高，電動電位越小，泳動速度慢。：除分子伴侶和折疊酶外；還與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)（形成轉(zhuǎn)角的殘基數(shù)目及平均帶電性等）和生長條件（宿主、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基和pH等）有關(guān)。 注意事項：與Lowry相比，采用BCA法時，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值；為促進BCA法的反應進程，可將樣品適當加熱。 注意事項： ug～15 ug BSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系；反應10～15 min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀；若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確。CDK1使底物蛋白磷酸化224。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。2）病毒感染抑制細胞凋亡：許多病毒具有抑制細胞凋亡的機制，有利于建立持續(xù)感染、延長病毒復制時間、以最大限度產(chǎn)生子代病毒。主要方法有2種: 1）. TdT介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介導的原位的缺口平移(ISNT)。(3)Bcl2蛋白具抗氧化作用。(4)粒酶B介導的細胞凋亡：CrB由CTL分泌進入靶細胞胞漿后,，切割胞漿和核中的多種底物；Caspase依賴的死亡通路是CrB介導細胞死亡的重要途徑之一。 CDA游離并進入核內(nèi)降解DNA,）剪切細胞結(jié)構(gòu)蛋白：如Caspase對核板的降解作用。 DNA多態(tài)性標記的價值：1）為路標，構(gòu)建DNA標記的遺傳連鎖圖譜?？寺』蚨ㄎ环?；原位雜交法；原位PCR；定位克隆技術(shù)。（六 ）功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族：1）編碼某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等。(3). 序列保守性。:（一）分子量很大的DNA與蛋白質(zhì)形成染色體存在于