【正文】 分子生物學(xué)大題一、基因與基因組:(1).開(kāi)放閱讀框（open reading frame, ORF）:是始于起始密碼子并終于終止密碼子的一串密碼子。(2). 序列特征——密碼子偏愛(ài)和剪接點(diǎn)。(3). 序列保守性。(4). 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:尋找基因的表達(dá)產(chǎn)物——RNA或蛋白質(zhì).。(5). 基因失活。:（一）分子量很大的DNA與蛋白質(zhì)形成染色體存在于核內(nèi)。（二）轉(zhuǎn)錄與翻譯不同步，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?，功能相關(guān)基因分散排布，無(wú)操縱子結(jié)構(gòu)。（三） 基因組存在高比例的非編碼序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作進(jìn)化標(biāo)尺。（四） 大量重復(fù)序列（repeat sequence）存在。（五） 基因多為不連續(xù)的，被插入序列（IS）所分隔(這種現(xiàn)象稱為斷裂基因（split gene）. 斷裂基因由內(nèi)含子（intron）（非編碼序列）和外顯子（exon）（編碼序列）交替組成。（六 ）功能相關(guān)基因構(gòu)成各種基因家族：1）編碼某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等。 2）與染色體構(gòu)象、著絲粒形成有關(guān)。 3）參與基因的表達(dá)調(diào)控. 分類：1）倒位（轉(zhuǎn)）重復(fù)順序：指兩互補(bǔ)順序呈反向排列，形成回文結(jié)構(gòu)或發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；2）串連重復(fù)順序：由相同的核心順序（2~70bp）成串（頭尾相接）排列而成的高度重復(fù)順序。3）散在重復(fù)順序。:(1).家系分析法——發(fā)現(xiàn)感興趣的基因。通過(guò)分析統(tǒng)計(jì)家系中有關(guān)遺傳性狀的連鎖情況和重組率而進(jìn)行基因定位的方法。(2).體細(xì)胞雜交——初步的基因定位。(3). 核酸雜交技術(shù)——精確的基因定位?？寺』蚨ㄎ环?；原位雜交法；原位PCR；定位克隆技術(shù)。：1)相引是兩個(gè)基因位于同一染色體上，相斥則反之；2)同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生交換；3)位置相近的因子相互連鎖?！膹垐D：1）遺傳圖:第一代遺傳標(biāo)記是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多態(tài)性）。第二代遺傳標(biāo)記是STR（short tandem repeat，簡(jiǎn)短串連重復(fù)序列 ），6000個(gè)標(biāo)記。第三代遺傳標(biāo)記是SNP（restriction fragment length polymorphism，單核苷酸多態(tài)性），不再是分析長(zhǎng)度，而是直接測(cè)序2）物理圖:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列標(biāo)記位點(diǎn)）并有染色體定位為路標(biāo)，以Mb或Kb為圖距的基因組圖。3）轉(zhuǎn)錄圖又稱表達(dá)序列圖或cDNA圖的路標(biāo):是以部分5 ’端或3’端cDNA序列（即表達(dá)序列標(biāo)簽，EST）為路標(biāo)，根據(jù)表達(dá)順序的位置和距離作圖4）序列圖：測(cè)定總長(zhǎng)約30億個(gè)核苷酸組成的全染色體序列。：、釀酒酵母、黑腹果蠅、秀麗線蟲(chóng)和小鼠，其序列分析被列為HGP的內(nèi)容；：DNA多態(tài)性:除同卵雙生的兩個(gè)體外，沒(méi)有兩個(gè)人的DNA組成是完全相同的，即人類DNA組成具有多態(tài)性。如果比較隨機(jī)的十個(gè)人的常染色體的非編碼區(qū),就會(huì)發(fā)現(xiàn)約200~400bp就有一個(gè)核苷酸不同,這些可變區(qū)域即稱為DNA多態(tài)性 (DNA polymorphism)位點(diǎn)。 DNA多態(tài)性標(biāo)記的價(jià)值：1）為路標(biāo)，構(gòu)建DNA標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。2）使遺傳圖譜從直接可見(jiàn)的表型多樣性標(biāo)記進(jìn)步到DNA分子本身多態(tài)性標(biāo)記。 DNA多態(tài)性的種類：1）DNA位點(diǎn)的多態(tài)性；2）串連重復(fù)順序多態(tài)性；3）單核苷酸多態(tài)性二、細(xì)胞凋亡1. 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別:項(xiàng)目 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素 生理性、弱刺激性 強(qiáng)烈刺激細(xì)胞數(shù)量 單個(gè)細(xì)胞丟失 成群細(xì)胞死亡膜完整性 保持至晚 早期即喪失染色質(zhì) 凝聚呈半月?tīng)? 稀疏呈網(wǎng)狀細(xì)胞核 早期固縮、斷裂 晚期破碎細(xì)胞器 無(wú)明顯變化 腫脹、破壞胞內(nèi)容物 無(wú)釋放 釋放細(xì)胞形狀 形成凋亡小體 破裂成碎片基因組DNA 受調(diào)控降解 隨機(jī)降解大分子合成 一般需要 不需要基因調(diào)控 有 無(wú)后果 不引起炎癥反應(yīng) 引起炎癥反應(yīng)意義 生理性死亡 病理性死亡：1）具有清除個(gè)體發(fā)育過(guò)程及成熟個(gè)體中多余細(xì)胞及老化細(xì)胞的機(jī)體調(diào)節(jié)作用；2）具有消除對(duì)機(jī)體有害的癌變細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞的機(jī)體防御作用。細(xì)胞凋亡是維持個(gè)體生存所必需的一種生物學(xué)機(jī)制。：Caspase即天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶。1）已在哺乳類中發(fā)現(xiàn)14種，分為3個(gè)亞類： Caspase1亞家族，Caspase2亞家族，Caspase3亞家族；2）根據(jù)前體分子(procaspase)N端的原結(jié)構(gòu)域(prodomain)分為2類:啟始分子(initiator), 如10等，為蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效應(yīng)分子(effector),如7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細(xì)胞凋亡。：1）滅活細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白：非凋亡細(xì)胞中, CDA (caspase活化的DNAase)與其抑制蛋白(ICDA)結(jié)合。凋亡細(xì)胞中, caspase剪切ICDA。 CDA游離并進(jìn)入核內(nèi)降解DNA,）剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白：如Caspase對(duì)核板的降解作用。 在凋亡過(guò)程中, caspase在單一位點(diǎn)剪切核纖層蛋白(lamin), 導(dǎo)致核板塌陷, ）剪切效應(yīng)蛋白: 如參與基因表達(dá)蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制劑。:(1).同一性：各種因素引起的凋亡的形態(tài)與生化改變均相同。(2).多樣性：環(huán)境因素不同，細(xì)胞類型不同，或刺激因素不同時(shí)，從凋亡程序啟動(dòng)到凋亡發(fā)生，其信號(hào)傳遞途徑是不同的。(3).分類：百余種凋亡調(diào)控因子，正逐漸被組裝成一條條的信息傳導(dǎo)通路，可分為基本傳導(dǎo)通路和非專一性傳導(dǎo)通路二類。:(1)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。(2)線粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導(dǎo)途徑：線粒體跨膜電位(Δψm)的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）破壞或開(kāi)放，開(kāi)放的后果是， Δψm 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習(xí)性循環(huán)。(3)細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)途徑。(4)粒酶B介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：CrB由CTL分泌進(jìn)入靶細(xì)胞胞漿后,，切割胞漿和核中的多種底物；Caspase依賴的死亡通路是CrB介導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要途徑之一。：自N端起包括：轉(zhuǎn)錄活化區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、四聚體化區(qū)和C調(diào)節(jié)區(qū)；1）P53的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)。正常狀態(tài)下：胞漿P53水平很低，半衰期很短；胞內(nèi)P53被嚴(yán)格監(jiān)控，受HDM2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，并通過(guò)泛素降解途徑調(diào)節(jié)P53水平。異常情況下：當(dāng)細(xì)胞DNA損傷、紡錘體絲斷裂、癌基因異常表達(dá)等細(xì)胞生存面臨威脅時(shí)； P53水平迅速升高和活化；2）P53對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用：野生型P53蛋白具維持細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制惡性增殖的作用； P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。突變型P53蛋白：?jiǎn)适б种萍?xì)胞惡性增殖功能，p53基因突變是50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因。并且本身具有癌基因功能。:(1)屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，但對(duì)細(xì)胞周期和分化無(wú)影響.(2)阻止或減少各種刺激引起的細(xì)胞損傷。如Bcl2能阻止由r射線和多種化療藥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。(3)Bcl2蛋白具抗氧化作用。(4)Bcl2蛋白抑制細(xì)胞器內(nèi)Ca2+ 離子向胞質(zhì)釋放，而凋亡必須有Ca2+ 離子參與。：1）抑制凋亡：bcl2，bclxL，Mcl1 。2）促進(jìn)凋亡：bax，bclxs ，bad。10. Bcl2家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制:(1)BclBax和Bclx組成一個(gè)凋亡調(diào)控系統(tǒng)。(2)當(dāng)Bax/Bax同源二聚體形成時(shí)，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(3).隨bcl2表達(dá)量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導(dǎo)凋亡的作用。即Bax和Bcl2 比值調(diào)節(jié)凋亡；(4) 當(dāng)Bclxs存在時(shí)，優(yōu)先形成Bclxs/Bcl2 ，使Bax/Bax形式保留，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA斷裂，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）或DNA聚合酶將帶有生物素標(biāo)記的核苷酸（biotin16dUTP）摻入到斷裂的DNA的3’端，再使其與帶有辣根過(guò)氧化物酶的抗生物蛋白結(jié)合，經(jīng)DAB顯色后，便可觀察到細(xì)胞內(nèi)是否存在DNA片段端存在。主要方法有2種: 1）. TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介導(dǎo)的原位的缺口平移(ISNT)。該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細(xì)胞.：1）.癌癥；2）.自身免疫性疾病，紅斑濃瘡，免疫介導(dǎo)的腎小管腎炎。3）.病毒感染與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)的疾?。?）.AIDS；2）. 神經(jīng)退行性病變，帕金森病，老年癡呆；3）再生性障礙貧血；4）.缺血性損傷，心肌梗塞，腦卒中，再灌注損傷；5）.酒精肝：正常情況下：1） 90%以上的淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育都會(huì)發(fā)生凋亡，那些能識(shí)別自身抗原的細(xì)胞都應(yīng)被清除，確保被選擇生存下來(lái)的淋巴細(xì)胞不至于對(duì)自身抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答；2）如果這種選擇性清除失敗，在靶細(xì)胞存在下，淋巴細(xì)胞被激活，產(chǎn)生大量的效應(yīng)細(xì)胞攻擊靶細(xì)胞，導(dǎo)致發(fā)生自身免疫性疾病。發(fā)病的分子機(jī)制：1）淋巴細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵分子是細(xì)胞表面受體Fas（又稱APO或CD95）， Fas受體與FasL （配體）結(jié)合即可激活凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞凋亡；2） T細(xì)胞表面受體Fas和FasL發(fā)生突變時(shí)，T細(xì)胞不能發(fā)生正常凋亡，導(dǎo)致自身免疫性疾病。3）除系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?，還證實(shí)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癬均與淋巴細(xì)胞凋亡敏感性改變（Fas和FasL突變）有關(guān)。：病毒的溶解性感染所產(chǎn)生的細(xì)胞病變變作用與引發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)；而病毒的持續(xù)性感染與病毒抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。1）病毒感染引發(fā)細(xì)胞凋亡：牛皰疹病毒、雞白血病毒和HIV等，均能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而引起宿主細(xì)胞缺失。如HIV感染后引起CD4+T細(xì)胞凋亡而缺失。2）病毒感染抑制細(xì)胞凋亡：許多病毒具有抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制，有利于建立持續(xù)感染、延長(zhǎng)病毒復(fù)制時(shí)間、以最大限度產(chǎn)生子代病毒。如EB病毒產(chǎn)生LMP1，使Bcl2基因上調(diào)；牛痘病毒產(chǎn)生crmA,可抑制由caspase所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。：腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常疾病，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡異常疾病。1）大多數(shù)腫瘤P53突變、而有些腫瘤過(guò)度表達(dá)Bcl2蛋白，這些可有效地以避免細(xì)胞凋亡發(fā)生。2）P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。3）Bcl2屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。三、細(xì)胞周期調(diào)控：：1）間期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。：細(xì)胞周期引擎——異二聚體蛋白激酶復(fù)合體，包括二個(gè)亞單位：1）調(diào)節(jié)亞單位：細(xì)胞周期蛋白，其濃度隨細(xì)胞周期不斷變化，不僅起激活CDK的作用，還決定了CDK何時(shí)、何處、將何種底物磷酸化；2）催化亞單位：細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 (CDK)，單獨(dú)存在時(shí)無(wú)活性，與cyclin結(jié)合才具有蛋白激酶的活性。參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子：1）異二聚體蛋白激酶復(fù)合體；2）生長(zhǎng)因子；3）泛素與APC：泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素；泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被摧毀的標(biāo)簽。4）周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI） ：1）細(xì)胞周期的啟動(dòng)（G0→G1）；2)DNA復(fù)制（ G0→S ）；3）進(jìn)入M期 (G2M)； 1）細(xì)胞周期的啟動(dòng)：細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下，Cyclin D表達(dá)，與CDKCDK6結(jié)合而活化激酶224。下游蛋白質(zhì)磷酸化224。促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄2）DNA復(fù)制：CyclinE與CDK2結(jié)合224。SCDK觸發(fā)前復(fù)制復(fù)合體（preRC）啟動(dòng)，同時(shí)阻止DNA再次進(jìn)行復(fù)制.3）進(jìn)入M期 (G2M)：CyclinA、CyclinB與CDK1結(jié)合，形成 MCDK224。CDKCyclin能夠積累224。CDK1使底物蛋白磷酸化224。細(xì)胞分裂.、信號(hào)傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器構(gòu)成，主要檢驗(yàn)點(diǎn)有4個(gè)：1) G1/S檢驗(yàn)點(diǎn): 在哺乳動(dòng)物中稱R點(diǎn)(restriction point)，控制細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)的G1進(jìn)入DNA合成期，相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細(xì)胞外環(huán)境適宜？細(xì)胞體積足夠大？2) S期檢驗(yàn)點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？3) G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)：是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，相關(guān)的事件包括：DNA損傷？細(xì)胞體積足夠大？4)中后期檢驗(yàn)點(diǎn)（紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)）：任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接到紡錘體上，都會(huì)抑制APC的活性，引起細(xì)胞周期中斷。四、蛋白質(zhì)分離純化：1）紫外光譜 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡(jiǎn)便的方法。 注意事項(xiàng)：石英比色杯；調(diào)零所用溶液；配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液；光密度范圍。 2）Bradford檢測(cè)法：考馬斯亮藍(lán)G250在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成