【正文】 淡紅色溶液，當與蛋白質結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩(wěn)。藍色復合物在595 mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質濃度成正比，因此可檢測595 mn的光吸收值大小計算蛋白的含量。 缺點：對各種純化蛋白質反應不同；這種測定方法對蛋白質引起不可逆的變性。 注意事項： ug～15 ug BSA濃度范圍內保持線性關系；反應10～15 min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀；若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確。3）Lowry檢測法：在堿性溶液中形成銅蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸磷鎢酸試劑(Folin酚試劑)，產生鉬藍和鎢藍復合物的深藍色，這種深藍色的復合物在745 ～750 nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比，可根據(jù)750 nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量。 缺點：干擾物質多；反應速度慢；某些試劑不穩(wěn)定；使蛋白質發(fā)生不可逆變性。 注意事項：在加入試劑30 min后呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱；許多干擾物質降低顏色反應；高鹽濃度可引起沉淀。4）BCA (二喹啉甲酸)檢測法：改進的Lowry測定法，反應簡單而且?guī)缀鯖]有干擾物質的影響。 原理：在堿性環(huán)境下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結合，形成穩(wěn)定的有顏色的復合物，在562 nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計算蛋白質的含量。 注意事項：與Lowry相比，采用BCA法時，如果樣品中含有脂類物質將明顯提高光吸收值；為促進BCA法的反應進程，可將樣品適當加熱。2. 經典的細胞蛋白質分離純化流程由下述主要步驟組成：(1). 清洗組織或細胞。(2). 裂解細胞。(3). 離心除去膜組分等獲得可溶性蛋白質。(4). 離心、層析、電泳等進一步純化。(5). 獲取產物蛋白。3. 包涵體的成份：包涵體是表達蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主細胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和質粒編碼蛋白以及LPS。4. 包涵體的形成原因：表達蛋白不適當?shù)闹虚g折疊體高濃度聚集在一起形成的不溶物。：除分子伴侶和折疊酶外；還與蛋白質本身的性質（形成轉角的殘基數(shù)目及平均帶電性等）和生長條件（宿主、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基和pH等）有關。：降低細胞生長溫度；共表達分子伴侶；改變滲透壓；融合蛋白： 用變性劑使之成為可溶性的伸展的肽鏈，然后再在適當?shù)臈l件下復性折疊成天然的、有活性的蛋白質分子。：破碎細胞224。分離包涵體224。溶解包涵體（用6～8mol/L或 9～10mol/ ～）224。蛋白質產物的構型復原：(1)帶電顆粒的性質：即凈電荷數(shù)量、顆粒大小及形狀。(2)電場強度：指每厘米的電位降，也稱電位梯度，或電勢梯度。(3)溶液的pH值：決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定所帶凈電荷的多少。(4)溶液的離子強度：影響電動電位，緩沖液離子強 度越高，電動電位越小，泳動速度慢。(5)電滲：在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負離子使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液就向一定的方向移動.(6)支持介質的選擇：(7)其它因素：:(1)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有三種離子，兩種不同孔徑的凝膠，兩種或兩種以上不同pH的緩沖溶液.(2)．所謂不連續(xù)就是指凝膠濃度不一樣，緩沖液離子成分及pH不一樣。(3)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，有三種物理效應，即樣品的濃縮效應、分子篩效應及電荷效應。由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。：(1)凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠 (stacking gel)； 分離膠 (separating gel)(2)緩沖液離子成分的不連續(xù)性：快離子(前導離子, leading ion)；慢離子(尾隨離子, trailing ion)；緩沖配對離子(緩沖抗衡離子,the buffer counter ion)。 (3)電位梯度的不連續(xù)性：在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度的差異是自動形成的。(4)pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH：： 分離膠pH：； 緩沖液pH：。在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性，是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。由于電泳基質的上述四個不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時得以濃縮，然后再被分離。： SDS作用：1）與蛋白牢固結合，由于十二烷基硫酸根帶負電荷，使得樣品中各種蛋白質與SDS形成的SDS蛋白質復合物都帶有相同密度的負電荷，掩蓋了蛋白質分子間天然的電荷差異；2）SDS蛋白質復合物分子構型也幾乎相同，而且具有相同的荷質比，因此在SDSPAGE中，SDS蛋白質復合物的電泳遷移率只與菌、酵母等的破碎。2）物理法： A. 超聲法：在處理少量樣品時操作簡便、效率高，液量損失少，適于實驗室使用。注意: 超聲波產生的化學自由基團能使敏感的活性物質變性失活，另外噪聲也比較大。 ：由于在此過程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質。 ：絕大多數(shù)細胞被破壞，一般適用于從細菌或病毒中提取蛋白質。 D. 低滲裂解：是指無胞壁細胞在低滲溶液中通過滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細胞的裂解3）化學法：：有些有機溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細胞壁或膜的通透性，使內含物有選擇性的滲透出來。 ：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX100、去氧膽酸鈉等。 ：必須根據(jù)細胞的結構和化學組成選擇適當?shù)拿?：1）利用溶解度的差異分離：。 ：有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質分子之間不同電荷的引力，導致溶解度的降低；另外有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質的水化膜，使蛋白質在一定濃度的有機溶劑中沉淀析出。 。 2）根據(jù)分子量的不同分離：.； ； 。 3）根據(jù)電荷的不同分離：； 。 4）親和層析。：1）假設有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑；2）A物質在兩相中相互擴散；3）A物質在兩相中達到了平衡(在同一時間內，進出兩相的A物質的分子數(shù)完全相等)時，其分配系數(shù)為常數(shù)K=CAS/ CAM。：1）分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的；2）在分配層析柱中，物質只有橫向擴散，沒有縱向擴散，而且在兩相間達到分配平衡的速度很快；3）體系中其他物質的存在不影響待分離物質的分配。 待分離物質的存在也不影響其他物質的分配；4）在分配層析柱上，物質在各個理論塔板中的含量可通過計算求得。18. 區(qū)帶電泳的優(yōu)點：1）是帶電的物質，都可采用某種電泳技術，分離成不同位置的區(qū)帶，對區(qū)帶可進行定性或定量分析；2）樣品用量少；3）設備簡單；4）可在室溫進行；5）操作簡便，化時間不多；6）不同類型的電泳，有不同的用途；7）改進或找到更好的支持介質，就有可能大大提高分辨率。19 .聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)：聚丙烯酰胺凝膠的性能：1）機械強度好，有彈性透明，相對地化學穩(wěn)定，對pH和溫度變化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的；2）沒有吸附和電滲作用. 通過改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑變化在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復性好；3）由于純度高及不溶性，還適合于少量樣品的制備， 不致污染樣品。 制備：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)；2）催化劑：引發(fā)劑（過硫酸銨, (NH4)2S2O8），加速劑（四甲基乙二胺, TEMED；3）化學聚合和光聚合兩種；4）凝膠濃度和交聯(lián)度；5）不連續(xù)系統(tǒng)制備。 可能出現(xiàn)的問題及解決措施：1）條帶過淡：上樣量不足；染色操作錯誤；2）條帶丟失：電泳時間過長，小條帶已跑出膠；膠濃度不正確。3）多余條帶：還原劑過量。4）條帶模糊：被降解。 藥品不純。5）條帶位置錯誤：被降解；上樣量過大；電泳條件不正確；上樣前加熱不夠；還原劑失效。6）條帶不整齊：孔徑不均一；膠聚合太快，不均一；可能有氣泡；樣品離子強度過大。7）條帶擴散：電壓過低，電泳時間過長；緩沖液離子強度太低；樣品本身結構不均一。8）條帶彎曲：電泳過程產熱過多；染色、固定時間短。9）拖尾：樣品溶解不充分；膠板不干凈。20. 蛋白質的濃縮：1）超濾法；2）冷凍干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等； 4）沉淀法。 五、酵母細胞雙雜交系統(tǒng)：1）酵母雙雜交；2）親和層析；3）免疫共沉淀；4）蛋白質交聯(lián)；5）基于GFP的細胞內蛋白質相互作用的研究方法；6）噬菌體顯示系統(tǒng)篩選。：轉錄激活因子上有DNA結合結構域(BD)與轉錄激活結構域(AD)。單獨的BD雖然能和啟動子結合,但不能激活轉錄。單獨的AD也不能激活轉錄。與調控目的基因有關的兩個蛋白質X蛋白與Y蛋白,將X蛋白的編碼基因與BD結構域基因融合(表達所得的融合蛋白為”誘餌”蛋白), ,Y蛋白的編碼基因與AD結構域基因融合(表達所得的融合蛋白稱為”獵物”蛋白)。如果X蛋白與Y蛋白之間存在相互作用,那么分別位于這兩個融合蛋白(”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的轉錄激活因子,從而激活相應基因(報告基因)的轉錄與表達. 通過對報告基因表達產物的檢測,反過來可斷別作為”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白的兩個蛋白質之間是否存在相互作用.: (1)．易于轉化、便于回收擴增質粒。(2)．具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報告基因。(3)．酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結合：(1)．基因組中GAL4基因是缺失型的。(2)．基因組中引入額外的報告基因LEU、TRP、HIS。 (3)通過功能互補和顯色反應篩選到陽性菌落。：1）表達“誘餌”和“獵物”蛋白；2）檢驗這兩種蛋白表達后能否激活酵母中的報告基因做法：首先構建能表達“誘餌”和“獵物”蛋白的表達載體。該載體中可加入進行營養(yǎng)型篩選的基因。：(1)．高敏感性；(2)．真實性；(3) 簡潔性；（4）廣泛性。(1)．高敏感性。原因：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體，使融合蛋白過量表達；②激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物，之后又與啟動子結合，此三元復合體使融合蛋白各組分間結合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號放大； ④檢測的結果是基因表達產物的累積效應，可檢測存在于蛋白質間的微弱或暫時的相互作用。(2)真實性。檢測在活細胞內進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內的真實情況。(3)簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質的繁瑣步驟。(4)廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和功能的蛋白質，適用于部分細胞質、細胞核及膜結合蛋白。p：(1)分析已知蛋白之間的相互作用。(2)對蛋白質功能域的分析，如可將待測蛋白質進行點突變或缺失突變再進行雙雜交。(3) 用已知功能蛋白質篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。(4) 分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。(5) 繪制蛋白質相互作用系統(tǒng)圖譜。(6) 在藥物設計中的應用。：1）假陽性較多；2）轉化效率偏低；3）陰性干擾。1）假陽性定義：在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下，報告基因仍被激活。 原因：①BD融合誘餌蛋白的單獨激活作用。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特異性結合，則可單獨激活報告基因的表達。③AD融合蛋白直接與轉錄因子相互作用激活報告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來許多假陽性。 排除假陽性的措施：①作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。②采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區(qū)各不相同。目前試劑公司已采用。③報告基因整合到染色體上，可使基因表達水平穩(wěn)定。④優(yōu)化3AT(3aminotriazole)濃度。適當增加濃度可減少假陽性。2）轉化效率偏低：辦法：引進酵母接合型3）陰性干擾：兩個蛋白本應發(fā)生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。 原因：（1）融合蛋白的表達對細胞有毒性時，應選擇敏感性較低的菌株或拷貝數(shù)低的載體；（2）蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株或多拷貝載體。（3）蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉入胞核。：(1)某些誘餌蛋白具有自身激活性質。雙雜交前刪除該部分，但應避免刪除相互作用的結構域。(2)某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達或不能準確定位到胞核內。在細胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。(3)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應在核內無法進行。(4)有時DNABD或AD融合部分不包括相互作用位點，或破壞了融合蛋白的正確折疊。(5) 哺乳動物蛋白之間相互作用有時要求正確的折疊和翻譯后修飾，而酵母細胞不能提供這樣的環(huán)境。這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究。陽性克隆必須進行體外翻譯和表達，用抗原表位特異性的抗體進行共定位研究. 雙雜交系統(tǒng)的得到的陽性結果一定要通過其它的實驗手段來驗證。，結構域中的DNABD位于N末端，能識別位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C末端。當Gal4的兩個結構域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復Gal4作為轉錄因子的活性。兩個融合蛋白分別構建在穿梭質粒上，一個是將Gal4的DNABD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。當兩種穿梭質粒共轉化含有Gal4結合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNABD與Gal4的AD靠近, 形成復合物，激活報告基因LacZ的轉錄。：原理 ：利用靶DNA序列，捕獲具有與該元件特異結合的結構域的蛋白質。即靶DNA序列特異的結合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結構域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結合位點之間通過相互作用激活報告基因的表