【正文】 桿狀病毒表達(dá)載體和桿狀病毒共轉(zhuǎn)染方法：A：用重組轉(zhuǎn)移載體與野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞而得到重組桿狀病毒。5 ）.外源基因的大小: 注意載體對外源基因的容量要求。：1）基因分析：（一）基因缺失的檢測；（二）基因突變的檢測；（三）基因易位的檢測；（四）外源致病基因的檢測；2）定位克??；3）序列分析。端限定PCR產(chǎn)物的長度, 5 39。：1）寡核苷酸引物。PCR反應(yīng)的特異性依賴于2個與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，取決于2個引物設(shè)計的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性，退火溫度。(6)寡核苷酸探針的標(biāo)記：在DNA合成時加入特定標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。非放射性標(biāo)記物：優(yōu)點(diǎn)：1）無放射性污染；2）穩(wěn)定性好,可較長時間存放。(2).標(biāo)記物與核酸探針分子的結(jié)合，不影響探針的主要理化特性，絕對不能影響其堿基對特異性。：相同點(diǎn)：基本原理。3）缺點(diǎn)：只能合成較小片段的DNA；目的基因DNA序列需通過氨基酸序列推測，難于保證與天然基因序列一 致，導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。 2）DNA 3′末端的同位素標(biāo)記。 ②65℃，20min。 （二）按受體細(xì)胞分類：1）原核細(xì)胞載體：原核克隆型載體，原核表達(dá)型載體； 2）真核細(xì)胞載體（穿梭載體）：真核表達(dá)型載體，真核轉(zhuǎn)遞型載體。若X蛋白能與RNA結(jié)合，則AD靠近報告基因，使其激活。③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。兩個融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNABD與酵母蛋白SNF1融合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。④優(yōu)化3AT(3aminotriazole)濃度。這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。(3) 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。(2)真實(shí)性。(3)．酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結(jié)合：(1)．基因組中GAL4基因是缺失型的。20. 蛋白質(zhì)的濃縮：1）超濾法；2）冷凍干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等； 4）沉淀法。3）多余條帶：還原劑過量。：1）假設(shè)有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑；2）A物質(zhì)在兩相中相互擴(kuò)散；3）A物質(zhì)在兩相中達(dá)到了平衡(在同一時間內(nèi)，進(jìn)出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時，其分配系數(shù)為常數(shù)K=CAS/ CAM。 D. 低滲裂解：是指無胞壁細(xì)胞在低滲溶液中通過滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細(xì)胞的裂解3）化學(xué)法：：有些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來。(4)pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH：： 分離膠pH：； 緩沖液pH：。(2)電場強(qiáng)度：指每厘米的電位降，也稱電位梯度，或電勢梯度。3. 包涵體的成份：包涵體是表達(dá)蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主細(xì)胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和質(zhì)粒編碼蛋白以及LPS。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值。藍(lán)色復(fù)合物在595 mn波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測595 mn的光吸收值大小計算蛋白的含量。SCDK觸發(fā)前復(fù)制復(fù)合體（preRC）啟動，同時阻止DNA再次進(jìn)行復(fù)制.3）進(jìn)入M期 (G2M)：CyclinA、CyclinB與CDK1結(jié)合，形成 MCDK224。3）Bcl2屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命。1）病毒感染引發(fā)細(xì)胞凋亡：牛皰疹病毒、雞白血病毒和HIV等，均能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而引起宿主細(xì)胞缺失。即Bax和Bcl2 比值調(diào)節(jié)凋亡；(4) 當(dāng)Bclxs存在時，優(yōu)先形成Bclxs/Bcl2 ，使Bax/Bax形式保留，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。:(1)屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命，但對細(xì)胞周期和分化無影響.(2)阻止或減少各種刺激引起的細(xì)胞損傷。(2)線粒體相關(guān)蛋白的凋亡誘導(dǎo)途徑：線粒體跨膜電位(Δψm)的下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPT）破壞或開放，開放的后果是， Δψm 下降、氧化磷化脫偶聯(lián)、GSH耗竭、ROS產(chǎn)生等，并形成惡習(xí)性循環(huán)。：1）滅活細(xì)胞內(nèi)凋亡抑制蛋白：非凋亡細(xì)胞中, CDA (caspase活化的DNAase)與其抑制蛋白(ICDA)結(jié)合。：、釀酒酵母、黑腹果蠅、秀麗線蟲和小鼠，其序列分析被列為HGP的內(nèi)容；：DNA多態(tài)性:除同卵雙生的兩個體外，沒有兩個人的DNA組成是完全相同的，即人類DNA組成具有多態(tài)性。(2).體細(xì)胞雜交——初步的基因定位。（四） 大量重復(fù)序列（repeat sequence）存在。分子生物學(xué)大題一、基因與基因組:(1).開放閱讀框（open reading frame, ORF）:是始于起始密碼子并終于終止密碼子的一串密碼子。（三） 基因組存在高比例的非編碼序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作進(jìn)化標(biāo)尺。通過分析統(tǒng)計家系中有關(guān)遺傳性狀的連鎖情況和重組率而進(jìn)行基因定位的方法。3）轉(zhuǎn)錄圖又稱表達(dá)序列圖或cDNA圖的路標(biāo):是以部分5 ’端或3’端cDNA序列（即表達(dá)序列標(biāo)簽，EST）為路標(biāo)，根據(jù)表達(dá)順序的位置和距離作圖4）序列圖：測定總長約30億個核苷酸組成的全染色體序列。1）已在哺乳類中發(fā)現(xiàn)14種，分為3個亞類： Caspase1亞家族，Caspase2亞家族，Caspase3亞家族；2）根據(jù)前體分子(procaspase)N端的原結(jié)構(gòu)域(prodomain)分為2類:啟始分子(initiator), 如10等，為蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的啟始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效應(yīng)分子(effector),如7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質(zhì)或酶，促使細(xì)胞凋亡。:(1)死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。并且本身具有癌基因功能。(2)當(dāng)Bax/Bax同源二聚體形成時，便誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(3).隨bcl2表達(dá)量增加，漸多的Bax/Bax解聚，形成更穩(wěn)定的Bax/Bcl2異源二聚體，從而中和了‘Bax/Bax’誘導(dǎo)凋亡的作用。：病毒的溶解性感染所產(chǎn)生的細(xì)胞病變變作用與引發(fā)細(xì)胞凋亡有關(guān)；而病毒的持續(xù)性感染與病毒抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。如果損傷不能修復(fù)， P53就激活那些誘導(dǎo)凋亡的基因表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)。促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄2）DNA復(fù)制：CyclinE與CDK2結(jié)合224。 2）Bradford檢測法：考馬斯亮藍(lán)G250在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。 原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡(luò)合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。(5). 獲取產(chǎn)物蛋白。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原：(1)帶電顆粒的性質(zhì)：即凈電荷數(shù)量、顆粒大小及形狀。 (3)電位梯度的不連續(xù)性：在不連續(xù)系統(tǒng)中，電位梯度的差異是自動形成的。 ：絕大多數(shù)細(xì)胞被破壞，一般適用于從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)。 4）親和層析。 可能出現(xiàn)的問題及解決措施：1）條帶過淡：上樣量不足；染色操作錯誤；2）條帶丟失：電泳時間過長，小條帶已跑出膠；膠濃度不正確。9）拖尾：樣品溶解不充分；膠板不干凈。(2)．具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報告基因。原因：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體，使融合蛋白過量表達(dá)；②激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，之后又與啟動子結(jié)合，此三元復(fù)合體使融合蛋白各組分間結(jié)合更趨于穩(wěn)定；③通過mRNA使信號放大； ④檢測的結(jié)果是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。(2)對蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變再進(jìn)行雙雜交。 原因：①BD融合誘餌蛋白的單獨(dú)激活作用。③報告基因整合到染色體上，可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定。(2)某些蛋白在酵母中不穩(wěn)定表達(dá)或不能準(zhǔn)確定位到胞核內(nèi)。當(dāng)Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因。 ：基本原理：構(gòu)建3個雜交體：1） BD與一個位點(diǎn)特異的RNA結(jié)合蛋白融合，可結(jié)合到報告基因上；2） RNA(Y)，含有“誘餌”順序，且可結(jié)合到BD融合的蛋白質(zhì)上；3）與AD融合的X蛋白。：（一）按功能分類：1）克隆型載體； 2）表達(dá)型載體。 用途：構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫：1）標(biāo)準(zhǔn)的酶切體系：1μgDNA，20μl總反應(yīng)體積，1U酶，推薦的Buffer和溫度，反應(yīng)1h； 2）酶切體系組成：內(nèi)切酶 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇，保存，使用，稀釋（避免失活與污染）； DNA底物純度，含量； 反應(yīng)buffer 嚴(yán)格按產(chǎn)品說明書 高、中、低鹽； 3）酶切溫度與時間：一般為37℃, 1h； 4）酶切反應(yīng)過程：容積：20μl，50μl, 酶容積≤10%, 即甘油≤ 5%；注意混勻；反應(yīng)終止：三種方法 :①10mM %SDS。 用途：1）主要作用是在載體或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。2）適用于氨基酸殘基數(shù)目較少的蛋白基因。 程序： 限制性內(nèi)切酶消化DNA→瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段→轉(zhuǎn)印到NC膜或尼龍膜→堿變性、中和→預(yù)雜交、雜交→放射性自顯影. 其基本原理毛細(xì)管轉(zhuǎn)移: 將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，再轉(zhuǎn)移到NC膜等固相載體上，用標(biāo)記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交。:(1).高度靈敏性。 缺點(diǎn)：1）半衰期短, 隨用隨標(biāo)；2）放射性污染。(5)cDNA探針的標(biāo)記：在反轉(zhuǎn)錄過程中選用反轉(zhuǎn)錄酶, 加入標(biāo)記的核苷酸, 引物可以特定的,也可以是隨機(jī)六核苷酸, 或oligo dT。七、DNA的P C R：類似于DNA的天然復(fù)制過程，是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5`末端和3`末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸，直至完成新的DNA合成，反復(fù)重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。：1）高度的敏感性：是最主要的特點(diǎn)，25個循環(huán)可擴(kuò)增106倍，它可對單拷貝、單根頭發(fā)、一滴血等微量標(biāo)本進(jìn)行分析；2）高度的特異性：取決于2個引物設(shè)計的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性，退火溫度；3）操作簡便、快捷；4）適用樣品的廣泛性。決定產(chǎn)物的特異性；6）引物的5 39。其他多種因素7. PCR的條件優(yōu)化：1）PCR循環(huán)數(shù)；2）使用增強(qiáng)劑（DMSO，PEG6000，甲酰胺，甘油，Tween20）；3）熱啟動PCR。3）. 篩選標(biāo)記的選擇；4）. 宿主選擇: 依據(jù)啟動子與宿主的相容性來選擇。大多含polyhedrin基因啟動子和外源插入位點(diǎn)，在啟動子上游（5 ’旁側(cè)）及外源插入基因下游（3’旁側(cè)）均有病毒基因序列。特點(diǎn)：能遠(yuǎn)距離增強(qiáng)啟制動子的活性； 無方向性，在啟動子的上游和下游均起作用； 對啟動子的影響無嚴(yán)格的專一性。按不同組合，估計需轉(zhuǎn)錄因子３００余個即可。：1）5′帽子結(jié)構(gòu)的作用：防止mRNA被5′→ 3′核酸酶降解；能被帽結(jié)合蛋白識別，增強(qiáng)mRNA的可翻譯性，沒帽子結(jié)構(gòu)，翻譯效率降低；促進(jìn)mRNA從核到胞漿的運(yùn)輸過程；增強(qiáng)mRNA的剪接效率, 帽對exon1的剪接尤為重要，需要2個帽結(jié)合蛋白參與（CBP80和CBP20）。(3).原核細(xì)胞缺乏RNA轉(zhuǎn)錄后加工的能力，所以真核目的基因?yàn)閙RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。 ：大腸桿菌（）；芽孢桿菌（Bacillus）；鏈霉菌（streptomyces）。3）啟動子具有可調(diào)控性，本底轉(zhuǎn)錄水平低。2）增加mRNA的穩(wěn)定性。：尋找差異表達(dá)的基因。 代表性差異分析技術(shù)的缺點(diǎn)：低豐度的身雜交的幾率很低；酶切連接步驟多，損失大；得不到全長cDNA。3） 檢測手段: 非常規(guī)的顯色或放射自顯影。(single strand formation polymorphism, SSCP)：1）分析原理：單個或多個堿基不同、但序列長度相等的雙鏈核酸分子，經(jīng)變性成單鏈后可具有不同的構(gòu)象，在中性PAGE中的電泳遷移率不同，與正常的電泳圖型對照，新生條帶出現(xiàn)即可判定存在堿基變異。1）作ASOH時，針對每種突變位點(diǎn)，分別合成2個寡核苷酸探針；其中一個能與正常序列完全互補(bǔ)，另一個則與具有突變的堿基序列完全互補(bǔ)；2）預(yù)雜交、雜交、洗膜、放射自顯影或顯色；使只有與探針序列完全互補(bǔ)的等位基因片段才顯示雜交信號，有錯配的探針則被洗脫，不顯示雜交信號；3）分析正常探針及突變探針分別雜交得到的顯影或顯色圖譜，即可作出基因診斷。不能形成胎兒HbF，但形成γ 4，稱為Hb Bart ( γ 4) 。靜止型 a 地貧與輕型 a 地貧個體婚配，可有1/4機(jī)會生育Hb H病患兒?；蛑委煹陌踩员O(jiān)測和療效評價.(方法)的選擇：1）直接法(體內(nèi)法) ( in vivo )：特點(diǎn)：直接向體內(nèi)某組織(器官)轉(zhuǎn)基因。2）病毒學(xué)方法： 是指以重組病毒為載體，通過感染將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法。2）基因添加：在不去除異常基因的前提下， 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞(非定點(diǎn)整合)，以目的基因的表達(dá)產(chǎn)物來補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原來的功能得到加強(qiáng)。(ADA)缺陷病的基因治療：1），基因全長32kb， mRNA長1 530bp。2）腫瘤細(xì)胞的基因“修飾”。(4)掃描與圖像分析，數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理與分析。 壓印獲得芯片(特定位點(diǎn))224。6）雜交反應(yīng)條件與反應(yīng)條件的優(yōu)化。溶解樣品。靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。3）PTK與細(xì)胞生長、增殖、癌變有關(guān)。2）其作用與蛋白激酶相反，）抑癌基因產(chǎn)物PTEN是一種磷酸酶，可使PIP3脫磷酸化為PIP2，也可催化蛋白質(zhì)中磷酸酪氨酸或絲/蘇氨酸脫磷酸(PLC) ：PIP2＋H2O－→IP3＋ DAG(PIK) ：不同的kinase 利用ATP催化PI逐級磷酸化 PI→PI4P→PI(4,5)P2 → PI(3,4,5)P3。：1）高度專一性；2）高度親和力；3）可飽和性；4）可逆性；5）特定的作用模式。蛋白激酶224。：1）組成:受體，鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，cGMP, 蛋白激酶G (