【正文】 的長(zhǎng)度, 5 39。端不能有任何修飾, 3 39。不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C；3）避免兩引物間的互補(bǔ),特別是3 39。 配制時(shí)注意:① 由于引物呈很輕的干膜狀附在管壁上,打開時(shí)極易散失, 故打開管子前要先離心, 再慢慢打開,溶解時(shí)加足量水后蓋蓋,充分上下振蕩5～10min② 溶解后分裝, 凍存于20℃；2） PCR反應(yīng)緩沖液：TrisCl（pH ～)； KCl或(NH4)2SO4:促使引物退火； MgCl2:影響酶活與精確度,產(chǎn)物的特異性； 明膠或BSA或Tween20:穩(wěn)定酶活性； 甲酰胺:使引物與模板特異性配對(duì)；3）耐熱DNA聚合酶；4）dNTP：常用濃度是20～200μmol/L；避免反復(fù)凍融, 分裝凍存于20℃；5）模板DNA：抽提方法：簡(jiǎn)單的水煮沸法，去垢劑裂解細(xì)胞→蛋白酶消化蛋白→有機(jī)溶劑抽提→乙醇沉淀核酸。：1）寡核苷酸引物。端沒(méi)有固定的終止點(diǎn)。5 39。(2)．單鏈DNA模板與引物退火 (annealing)：引物與模板形成復(fù)合物的幾率DNA分子自身的復(fù)性。PCR反應(yīng)的特異性依賴于2個(gè)與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物，取決于2個(gè)引物設(shè)計(jì)的好壞，依賴于引物與模板結(jié)合的正確性，退火溫度。：1）毛細(xì)管轉(zhuǎn)移；2）電轉(zhuǎn)移法；3）真空轉(zhuǎn)移法。生物素探針的檢測(cè)體系：①生物素探針+抗生物素蛋白+帶ALP或HRP的生物素+底物；②生物素探針+抗生物素抗體+ 抗生物素抗體的抗體+ABC試劑(底物:BCIP+NBT)?！淠┒藰?biāo)記，為加磷酸反應(yīng)，而且要讓p/32P進(jìn)入5′末端，故應(yīng)選擇[γ32P]ATP， 150μci/反應(yīng)。(6)寡核苷酸探針的標(biāo)記：在DNA合成時(shí)加入特定標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。(4)DNA的末端標(biāo)記。(2)隨機(jī)引物標(biāo)記法。 非放射性標(biāo)記物：1）生物素；2）地高辛；3）熒光素：FITC，羅丹明。非放射性標(biāo)記物：優(yōu)點(diǎn)：1）無(wú)放射性污染；2）穩(wěn)定性好,可較長(zhǎng)時(shí)間存放。：優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度極高；2）放射性核素對(duì)各種酶促反應(yīng)無(wú)任何影響,也不會(huì)影響堿基配對(duì)的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)；3）極高的特異性。(6).對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)人體無(wú)損傷。(4).檢測(cè)方法具有高度特異性。(2).標(biāo)記物與核酸探針?lè)肿拥慕Y(jié)合，不影響探針的主要理化特性，絕對(duì)不能影響其堿基對(duì)特異性。：1）寡核苷酸探針；2）基因組DNA探針；3）cDNA探針；4）RNA探針。 實(shí)質(zhì)是核酸分子的變性與復(fù)性過(guò)程。 Southern印跡雜交：堿變性: 用一已知的DNA或RNA片段(探針)來(lái)檢測(cè)樣品中未知的核苷酸序列，通過(guò)核苷酸間堿基互補(bǔ)的原理互相結(jié)合，再經(jīng)顯影或顯色的方法，將結(jié)合核苷酸序列的位置和大小顯示出來(lái)。：相同點(diǎn)：基本原理。、轉(zhuǎn)染程序：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌――― 感受態(tài)細(xì)菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培養(yǎng)重組質(zhì)粒DNA+細(xì)菌熱休克蛋（42度，90秒）普通培養(yǎng)基溫育涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板單菌落20. Southern印跡雜交是將經(jīng)凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到合適的固相支持物，再通過(guò)特異性探針的雜交來(lái)檢測(cè)被轉(zhuǎn)移的DNA片段的一種技術(shù)。3）人工接頭法：用于在質(zhì)粒和目的基因上沒(méi)有相同的酶切位點(diǎn)。 缺陷：高背景(自身環(huán)化)；雙向(正、反)插入；多拷貝插入。3）缺點(diǎn)：只能合成較小片段的DNA；目的基因DNA序列需通過(guò)氨基酸序列推測(cè)，難于保證與天然基因序列一 致，導(dǎo)致表達(dá)效率大大降低。：1）使用DNA合成儀。2）C文庫(kù)構(gòu)建方法：反轉(zhuǎn)錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。 用途：1. 在連接反應(yīng)中去除載體DNA片段5′P，防止載體自我連接. 2. 用32P標(biāo)記5′末端時(shí)，用此酶去除5′P，再用激酶進(jìn)行5′的 32P標(biāo)記.：1）基因組文庫(kù)(G文庫(kù))用基因克隆的方法保存宿主細(xì)胞中的DNA重組分子中的集合, 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列； 2）G文庫(kù)構(gòu)建方法：鳥槍法； 3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術(shù)。 2）DNA 3′末端的同位素標(biāo)記。(TdT)：功能：催化多個(gè)脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3′OH末端。催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。用途：1）隨機(jī)引物標(biāo)記法標(biāo)記探針主要用途；2）雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序；3）cDNA第二鏈的合成；4）DNA 3′突出末端進(jìn)行末端標(biāo)記(DNA ligase)——基因工程的縫紉針：催化雙鏈DNA相鄰堿基5′P和3′OH間磷酸二酯鍵形成的酶。 ②65℃，20min。(YAC)：1）酵母基因：著絲粒，端粒，自主復(fù)制順序； 2）質(zhì)粒pBR322衍生物：復(fù)制起點(diǎn)(ori)，Ampr基因。：① l噬菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是l噬菌體生長(zhǎng)所非必需的。：1）分子相對(duì)較小，具有較高的拷貝數(shù)； 2）含高效的復(fù)制子，可用氯霉素阻止細(xì)菌蛋白 質(zhì)的合成，非使質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加；3）具有多種遺傳選擇標(biāo)記，包括各種抗藥基因或營(yíng)養(yǎng)代謝基因等。 （二）按受體細(xì)胞分類：1）原核細(xì)胞載體：原核克隆型載體，原核表達(dá)型載體； 2）真核細(xì)胞載體（穿梭載體）：真核表達(dá)型載體，真核轉(zhuǎn)遞型載體。(4)表達(dá)型載體還應(yīng)有強(qiáng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。(2)有多克隆位點(diǎn)(多種酶單一位點(diǎn))，易于外源DNA分子與載體及重組。六、DNA重組\雜交1. DNA重組技術(shù)基本程序：外源DNA的獲取克隆載體的選擇與構(gòu)建目的基因與載體的連接 DNA導(dǎo)入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達(dá) ：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩。若X蛋白能與RNA結(jié)合，則AD靠近報(bào)告基因，使其激活。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補(bǔ)充，提出了創(chuàng)建整個(gè)有機(jī)體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。在這系統(tǒng)中，野生型BDX/ADY間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。③定位已經(jīng)證實(shí)的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。①確定已知DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。即靶DNA序列特異的結(jié)合蛋白(BDPX)與Gal4 P的激活結(jié)構(gòu)域可融合形成融合體，BDPX與其特異DNA結(jié)合位點(diǎn)之間通過(guò)相互作用激活報(bào)告基因的表達(dá)。當(dāng)兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因LacZ的酵母菌株后，通過(guò)SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNABD與Gal4的AD靠近, 形成復(fù)合物，激活報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個(gè)是將Gal4的DNABD與酵母蛋白SNF1融合；另一個(gè)是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。，結(jié)構(gòu)域中的DNABD位于N末端，能識(shí)別位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C末端。這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。(4)有時(shí)DNABD或AD融合部分不包括相互作用位點(diǎn)，或破壞了融合蛋白的正確折疊。在細(xì)胞表面發(fā)生的相互作用可采用噬菌體顯示系統(tǒng)。雙雜交前刪除該部分，但應(yīng)避免刪除相互作用的結(jié)構(gòu)域。（3）蛋白在酵母中不能穩(wěn)定地表達(dá)，或者不能正確地折疊，或雜交蛋白不能轉(zhuǎn)入胞核。2）轉(zhuǎn)化效率偏低：辦法：引進(jìn)酵母接合型3）陰性干擾：兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)。④優(yōu)化3AT(3aminotriazole)濃度。目前試劑公司已采用。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。③AD融合蛋白直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活報(bào)告基因；④AD融合靶蛋白與BD相互作用或者AD與BD融合蛋白之間的相互作用，尤其是后者帶來(lái)許多假陽(yáng)性。這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。1）假陽(yáng)性定義：在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因仍被激活。(6) 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)，再根據(jù)篩的已知基因推測(cè)新基因功能。(3) 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。p：(1)分析已知蛋白之間的相互作用。(4)廣泛性。(3)簡(jiǎn)潔性。(2)真實(shí)性。(1)．高敏感性。該載體中可加入進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型篩選的基因。 (3)通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。(3)．酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白相互結(jié)合：(1)．基因組中GAL4基因是缺失型的。如果X蛋白與Y蛋白之間存在相互作用,那么分別位于這兩個(gè)融合蛋白(”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因(報(bào)告基因)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá). 通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè),反過(guò)來(lái)可斷別作為”誘餌”蛋白與”獵物”蛋白的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用.: (1)．易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。單獨(dú)的AD也不能激活轉(zhuǎn)錄。：轉(zhuǎn)錄激活因子上有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。20. 蛋白質(zhì)的濃縮：1）超濾法；2）冷凍干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝膠等； 4）沉淀法。8）條帶彎曲：電泳過(guò)程產(chǎn)熱過(guò)多；染色、固定時(shí)間短。6）條帶不整齊：孔徑不均一；膠聚合太快，不均一；可能有氣泡；樣品離子強(qiáng)度過(guò)大。 藥品不純。3）多余條帶：還原劑過(guò)量。 制備：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)；2）催化劑：引發(fā)劑（過(guò)硫酸銨, (NH4)2S2O8），加速劑（四甲基乙二胺, TEMED；3）化學(xué)聚合和光聚合兩種；4）凝膠濃度和交聯(lián)度；5）不連續(xù)系統(tǒng)制備。18. 區(qū)帶電泳的優(yōu)點(diǎn)：1）是帶電的物質(zhì)，都可采用某種電泳技術(shù)，分離成不同位置的區(qū)帶，對(duì)區(qū)帶可進(jìn)行定性或定量分析；2）樣品用量少；3）設(shè)備簡(jiǎn)單；4）可在室溫進(jìn)行；5）操作簡(jiǎn)便，化時(shí)間不多；6）不同類型的電泳，有不同的用途；7）改進(jìn)或找到更好的支持介質(zhì)，就有可能大大提高分辨率。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的；2）在分配層析柱中，物質(zhì)只有橫向擴(kuò)散，沒(méi)有縱向擴(kuò)散，而且在兩相間達(dá)到分配平衡的速度很快；3）體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。：1）假設(shè)有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑；2）A物質(zhì)在兩相中相互擴(kuò)散；3）A物質(zhì)在兩相中達(dá)到了平衡(在同一時(shí)間內(nèi)，進(jìn)出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時(shí)，其分配系數(shù)為常數(shù)K=CAS/ CAM。 3）根據(jù)電荷的不同分離：； 。 。 ：必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?：1）利用溶解度的差異分離：。 D. 低滲裂解：是指無(wú)胞壁細(xì)胞在低滲溶液中通過(guò)滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細(xì)胞的裂解3）化學(xué)法：：有些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來(lái)。 ：由于在此過(guò)程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。2）物理法： A. 超聲法：在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便、效率高，液量損失少，適于實(shí)驗(yàn)室使用。由于電泳基質(zhì)的上述四個(gè)不連續(xù)性，使樣品在電泳開始時(shí)得以濃縮，然后再被分離。(4)pH的不連續(xù)性：濃縮膠pH：： 分離膠pH：； 緩沖液pH：。：(1)凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠 (stacking gel)； 分離膠 (separating gel)(2)緩沖液離子成分的不連續(xù)性：快離子(前導(dǎo)離子, leading ion)；慢離子(尾隨離子, trailing ion)；緩沖配對(duì)離子(緩沖抗衡離子,the buffer counter ion)。(3)．在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，有三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)。(4)溶液的離子強(qiáng)度：影響電動(dòng)電位，緩沖液離子強(qiáng) 度越高，電動(dòng)電位越小，泳動(dòng)速度慢。(2)電場(chǎng)強(qiáng)度：指每厘米的電位降，也稱電位梯度，或電勢(shì)梯度。溶解包涵體（用6～8mol/L或 9～10mol/ ～）224。：破碎細(xì)胞224。：除分子伴侶和折疊酶外；還與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)（形成轉(zhuǎn)角的殘基數(shù)目及平均帶電性等）和生長(zhǎng)條件（宿主、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基和pH等）有關(guān)。3. 包涵體的成份：包涵體是表達(dá)蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主細(xì)胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和質(zhì)粒編碼蛋白以及LPS。(4). 離心、層析、電泳等進(jìn)一步純化。(2). 裂解細(xì)胞。 注意事項(xiàng)：與Lowry相比，采用BCA法時(shí)，如果樣品中含有脂類物質(zhì)將明顯提高光吸收值；為促進(jìn)BCA法的反應(yīng)進(jìn)程，可將樣品適當(dāng)加熱。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值。4）BCA (二喹啉甲酸)檢測(cè)法：改進(jìn)的Lowry測(cè)定法，反應(yīng)簡(jiǎn)單而且?guī)缀鯖](méi)有干擾物質(zhì)的影響。 缺點(diǎn)：干擾物質(zhì)多；反應(yīng)速度慢；某些試劑不穩(wěn)定；使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。 注意事項(xiàng)： ug～15 ug BSA濃度范圍內(nèi)保持線性關(guān)系；反應(yīng)10～15 min后開始出現(xiàn)沉淀，尤其是高濃度蛋白質(zhì)溶液在酸性條件下易發(fā)生沉淀；若選用目的蛋白來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線或用另一種方法來(lái)校正，所測(cè)蛋白濃度較準(zhǔn)確。藍(lán)色復(fù)合物在595 mn波長(zhǎng)處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595 mn的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量。 注意事項(xiàng)：石英比色杯；調(diào)零所用溶液；配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶液；光密度范圍。四、蛋白質(zhì)分離純化：1）紫外光譜 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。CDK1使底物蛋白磷酸化224。SCDK觸發(fā)前復(fù)制復(fù)合體（preRC）啟動(dòng)，同時(shí)阻止DNA再次進(jìn)行復(fù)制.3）進(jìn)入M期 (G2M)：CyclinA、CyclinB與CDK1結(jié)合，形成 MCDK224。下游蛋白質(zhì)磷酸化224。參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子：1）異二聚體蛋白激酶復(fù)合體；2）生長(zhǎng)因子；3）泛素與APC：泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素；泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被摧毀的標(biāo)簽。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。3）Bcl2屬凋亡抑制基因，阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。2）P53蛋白作為“基因警衛(wèi)”負(fù)責(zé)維持基因組的完整性、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。：腫瘤不僅是細(xì)胞增殖和分化異常疾病，同時(shí)也是細(xì)胞凋亡異常疾病。2）病毒感染抑制細(xì)胞凋亡：許多病毒具