【正文】 對，而熱啟動PCR方法則可大大減少這種情況的發(fā)生。在得到足夠產物的前提下應盡量減少循環(huán)次數(shù)。目的片段小于150 bp時甚至可以省略延伸步驟，因為退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列合成。延伸時間取決于擴增片段的長度：目的片段小于500 bp時，延伸時間為20 s；目的片段在500～1200 bp時，延伸時間需40 s；目的片段大于1200 bp則還需增加延伸時間。退火時間一般為20～40 s，時間過短會導致延伸失??；時間過長則易產生引物二聚體或導致非特異性配對。退火溫度一般應比Tm值低3℃～12℃（5℃為宜，但不應超出15℃）。通常情況下，95℃變性20～30 s即可使各種DNA分子完全變性。（1）PCR反應循環(huán)參數(shù)：①變性：變性溫度過高或變性時間過長都會導致耐熱DNA聚合酶活性的喪失，從而影響PCR產物的產量。2. 條件優(yōu)化　PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據(jù)不同的目的及不同的DNA模板，探索最適條件，以獲得最佳反應結果。末端的限制，使終產物序列介于兩種引物539。整個PCR反應一般須進行30輪的循環(huán)。方向延伸合成新股DNA。端摻入，使引物沿539。由于添加的引物分子數(shù)遠大于模板DNA的分子數(shù)，因此引物與模板DNA形成復合物的幾率遠遠高于DNA分子自身的復性。①變性（Denature）：模板DNA在95℃左右的高溫條件下氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA并游離于反應液中。其次，盡量把引物放到不同的外顯子上，以便使特異PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區(qū)別。4. 引物的位置　引物的序列應位于基因組DNA中的保守區(qū)，且與非擴增區(qū)無同源序列，這樣可以減少引物與基因組的非特異結合，提高反應特異性。在此范圍內，既可以保證有效退火，又維持了良好的特異性。3. 引物G＋C含量和Tm值　引物G＋C含量應該保持在40%～75%之間。末端應盡量避免互補，以免形成“引物二聚體”造成引物浪費和非特異擴增。端最多可加到10個堿基而對PCR反應無影響。端加限制性內切酶位點、啟動子或其他序列等，以便于PCR產物的分析、克隆。端的堿基可不與模板DNA互補結合而呈游離狀態(tài)。末端的堿基并無嚴格限制。端。引物的最好選T、G、C而不選A；同時，引物的339。由于引物339。2. 引物末端　引物的339。注意，這里引物的長度是指與模板DNA序列互補的部分，并不包括為后續(xù)克隆而加的酶切位點等額外序列。1. 引物長度　在16～40 bp范圍內，以18～24 bp最佳。不過，我們也須根據(jù)實驗具體要求進行適當調整（如在醫(yī)學診斷中，可以以犧牲效率為代價調整引物以提高特異性，因為在臨床診斷中避免假陽性比產生大量擴增產物更重要）。引物設計需要在擴增特異性和擴增效率兩方面目標上取得平衡。當然，有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(yōu)化?！　《CR引物的設計PCR反應成功的一個關鍵條件是正確設計引物。PCR的基本反應步驟包括：（1）變性：將反應體系加熱至95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以打開；（2）退火：將溫度下降至適宜溫度使引物與模板DNA退火結合；（3）延伸：將溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶發(fā)揮酶活性，以dNTP為底物催化DNA的合成反應。重復這一過程，即可使目的DNA片段得以大量擴增（圖141）。末端和339。發(fā)明這一技術的K. Mullis因此貢獻而獲得了1993年度諾貝爾化學獎。 多聚酶鏈式反應即PCR（polymerase chain reaction）技術，應用這一技術可以將微量目的基因（DNA片段）擴增一百萬倍以上。 第二節(jié) 多聚酶鏈式反應技術（PCR技術） 20090602 17:37 尤其當待檢標本為陰性時，陽性對照片呈陽性反應可排除待檢標本假陰性的可能。4． 陽性對照　用已知含靶序列的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陽性，稱陽性對照。3． 陰性對照　用已知不存在相應靶序列的組織標本雜交，結果應為陰性。2． 自身對照　用同一組織切片或涂片上與靶序列無關的其他結構作對照。1． 省去標記探針　在做原位雜交時，以PBS或預雜交液替代雜交液，結果應為陰性，這是一種簡便而有意義的陰性對照實驗。結果：雜交陽性信號為紫藍色顆粒。顯色液臨用前配，其配方為：①NBT 45μl；②XPhospllate液 35μl；③左旋咪唑 ；④緩沖液Ⅱ 加至10ml。（6）緩沖液Ⅱ洗10min。（4）將抗體稀釋液滴加在切片上，封口膜覆蓋，濕盒內4℃孵育過夜。（2）用含2%％TritonX100的緩沖液I孵育切片30min。2． 顯色　以下各步均在室溫下進行。然后依次經2SSC室溫浸洗1h，lSSC室溫浸洗lh，SSC 37℃浸洗30min，SSC室溫浸洗30min。9． 預雜交液?。?0SSC ；鮭魚精DNA (10mg/m1) ；（沸水變性10min）；酵母tRNA (10mg/m1) ；50％硫酸葡聚糖 ；50Denhardt?蒺s液 。8． 50Denhardt39。6． 去離子甲酰胺　將陰陽離子交換樹脂各5g加入50ml甲酰胺中，待樹脂下沉后用上清液。（2） 緩沖液Ⅱ(pH )　為1mol TrisHCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。4． 4％多聚甲醛(pH )　為多聚甲醛4g； PBS 100m1。3． 20SSC　為NaCl(3mol/L) ；Na3C6H50H2O7B液： Na2HP04為Na2HPO4 (MW：，12H2O) ；DEPC水 。1． DEPC水　將DEPC按1‰濃度加入超凈水中，充分混合后靜置過夜，15~20min高壓消毒，之后室溫避塵存放。上述細胞片經酒精或多聚甲醛固定5min，其余步驟同冰凍切片。雜交前切片經①二甲苯脫蠟2次，每次10min；②純酒精洗2次，每次5min；③空氣干燥5min；④梯度酒精復洗95％，80％，70％各1min；⑤ mol PBS洗3次，每次5min；⑥2SSC洗10min；⑦滴加預雜交液于濕盒內室溫孵育1h。雜交前切片迅速恢復至室溫并干燥， PBS洗三次，2SSC洗10min，滴加預雜交液室溫孵育1h。亦可經15磅高壓滅菌20min處理，可將載玻片上的核酸酶消除。一般載玻片可先經洗衣粉浸泡過夜，用流水沖洗、酸中浸泡4～8h，再用流水沖洗，雙蒸水洗2～3次。必要時，動物組織可進行灌流固定，然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中，4℃過夜，次日可行冰凍切片。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點因此要根據(jù)具體的實驗對象，選擇最佳的固定液。2． 固定　進行原位雜交的組織或細胞必須經過固定處理，固定的目的是為了①保持細胞形態(tài)原有結構；②最大限度保存細胞內的DNA或RNA的水平；③使探針易于進入細胞或組織內。其基本方法包括：固定、切片、雜交、顯色等主要步驟。原位雜交可根據(jù)檢測物而分為細胞內和組織切片原位雜交；根據(jù)其用探針及檢測核酸的不同可分為DNADNA、RNADNA、RNARNA雜交。一般為1 μg DNA用1～2μg光敏生物素。此法適用于大于200bp的核酸片段的標記，小片段標記率不高。如果核苷酸上標記光敏生物素過多，會因空間位阻而影響探針與靶序列的雜交。用作標記探針的核酸最好不用Tris溶液溶解，Tris中所含氨基會干擾標記。在分裝試劑及核酸與光敏生物素混合時應在暗室安全燈下操作。適量分裝后20℃避光保存?zhèn)溆谩ｋx心洗滌沉淀(注意勿將沉淀吹散)。以4℃10 000g離心15min。加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉(pH5．2)和2倍體積冷無水乙醇，混勻。吸棄上相，加入等體積仲丁醇(或正丁醇)重復萃取一次。此后操作