分子生物學(xué)實驗技術(shù)-文庫吧資料
2025-01-05 15:14本頁面
【正文】 能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。實驗原理實驗原理? 本實驗以 JM83 菌株為受體細(xì)胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與 質(zhì)粒共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。)。分子的受體細(xì)胞 (? 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 (轉(zhuǎn)化子 )：帶有異源 DNACaCl RM轉(zhuǎn)化中的受體細(xì)胞? 分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術(shù)。)是將異源 實驗原理? 轉(zhuǎn)化 (轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。? 問題與討論：１．在整個酶切反應(yīng)過程中應(yīng)注意哪些問題？２．如何選擇ＤＮＡ和限制性內(nèi)切酶的用量？反應(yīng)體系中為何內(nèi)切酶用量不能超過整個反應(yīng)體系的１０％？實驗五、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 及外源 DNA的轉(zhuǎn)化實驗?zāi)康? 的意義。四．結(jié)果與分析１．記錄紫外透射儀上觀察到的結(jié)果。? ５．混勻后 ％瓊脂糖凝膠上 60伏電泳２小時。? ４．反應(yīng)結(jié)束后加入 4μl的 10XLoading? ２．將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺式離心機(jī)上短暫離心。? DNA? 100mMTrisPstⅠ 等，也有如 BclⅠ 需在５０ ℃ 下進(jìn)行反應(yīng)，? 反應(yīng)時間根據(jù)酶的單位與ＤＮＡ用量之比來定，原則是酶：ＤＮＡ =２－３：１? ２小時即可，充分酶解。HindⅢ ,不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。NaCl）? 高鹽（ 100mMHCl維持反應(yīng)體系 pH值在 ；? NaCl濃度不同形成３種級別的離子強(qiáng)度：? 低鹽（ 10mM３．反應(yīng)緩沖液：? 反應(yīng)緩沖液主要由 Tris? 這種抑制可通過：? 增加酶作用單位數(shù)（ 10~20U/ug? 同時內(nèi)切酶體積不能超過反應(yīng)體系１０％，因內(nèi)切酶中含５０％甘油，體系中甘油超過５％會抑制內(nèi)切酶活力；? 使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。1u指在適當(dāng)條件下， 1小時內(nèi)完全酶解１ ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以１ ug酶切反應(yīng)中應(yīng)注意以下幾個問題：１．內(nèi)切酶：? 不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；? 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， ? Ⅱ 型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５ ’端突出；３ ’端突出和平末端。它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段； ? 故 Ⅰ 類和 Ⅲ 類酶在基因工程中基本不用。? Ⅰ 類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點，且沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。? Ⅰ 類和 Ⅲ 類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴 ATP的限制性內(nèi)切酶活性。限制酶的類型? 根據(jù)限制酶的識別切割特性， ? 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 一．實驗?zāi)康募氨尘? 核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等動物的免疫系統(tǒng)， 五、實驗結(jié)果與討論? 根據(jù)觀察結(jié)果，繪圖。 EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。? EB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下 1520min；不會使核酸斷裂；靈敏度高， 10ng或更少的 DNA即可檢出；可以加到樣品中可膠中。常用染料? EB:溴化乙錠（ 3， 8二氨基 5乙基 6苯基菲啶溴鹽Ethidium Bromide， EB）， EB能插入 DNA分子堿基對之間，導(dǎo)致 EB與 DNA結(jié)合。 560 120 核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 線狀 DNA大小 /kb 瓊脂糖透明無紫外吸收 ，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。ng* 的條帶由 500bp和 517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強(qiáng)度也比較均一。ng10a 517 42ng8 1,500 36ng5 4,001 33ng3 6,001 50應(yīng)按 13條帶計算，因為 3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段 堿基對 質(zhì)量1 10,002 42?NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder雖然不能對 DNA質(zhì)量進(jìn)行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進(jìn)行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。 四、實驗操作步驟 2．凝膠加樣緩沖液 %溴酚藍(lán)， 50%蔗糖 3. 瓊脂糖 （ EB）， 4℃ 保存。 三、 儀器、材料與試劑 ? 可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA分子。具有不同的相對分子質(zhì)量的 DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。? 核酸為兩性分子，在 ，整個分子帶正電； PH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負(fù)電。二、實驗原理 一般DNA的純品，其比值為 ，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。 260nm 讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度， OD260值為 1相當(dāng)于約 50?g /ml雙鏈 DNA， 33?g /ml單鏈。2. 蒸餾水作為空白 ,在波長 260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。8. 將分離出的質(zhì)粒 DNA置于 20℃ 保存?zhèn)溆谩?. 沉淀用 70％乙醇清洗一次， 12023r/min離心 5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥 。質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。?. 加入 150 ? l乙酸鉀溶液 (溶液 II)，加蓋后顛倒 67次混勻， 冰上放置 5min。2. 取液體培養(yǎng)液 Eppendorf管中，10
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