分子生物學研究技術(shù)(理論)-文庫吧資料
2025-01-05 03:23本頁面
【正文】 釋 放 出 的 藍色 物 質(zhì) 可 以將 整 個 菌 落染 成 藍 色 ，非 常 容 易 辨別 。 通常將編碼該酶?片段 的 LacZ 基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中 ， 而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的 ?片段 。這樣，通過在培養(yǎng)基中加入特定的抗生素就可以選自得到轉(zhuǎn)化的細胞（菌）。 多克隆位點 ： 克隆載體中的一段用于插入外源 DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點應該在整個載體中是唯一的。 （ 6） 質(zhì)粒的存在形式 有超螺旋、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種， 雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋） 開環(huán)雙螺旋（一個裂口） 線狀雙螺旋（兩個裂口） 第一節(jié) 質(zhì)粒載體 （ plasimid vectors） 質(zhì)粒載體的生物學特性 質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹 質(zhì)粒： 是一種裸露的雙鏈閉環(huán) DNA分子，它們在寄主細胞中能夠獨立地自我復制從而得到不斷的繁殖。 不過 ， 即使是同一質(zhì)粒 ， 其拷貝數(shù)在不同的寄主細胞間也可能有很大的變化 。 （ 4） 質(zhì)粒的復制類型 一種質(zhì)粒在宿主細胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 。 （ 3） 質(zhì)粒的生存 在寄主細胞中 “ 友好 ” 地 “ 借居 ” ， 離開了寄主它本身無法復制 ， 它可以賦予 寄主一些非染色體控制的遺傳性狀 ， 以利于寄 主的生存。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒，目前對細菌的質(zhì)粒研究得比較深入，特別是大腸桿菌的質(zhì)粒。 D. 自身分子量較小，在寄主細胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。 Klenow片段的主要用途 A. 修補限制性酶消化 DNA形成的 3′ 隱蔽末端 B. 標記 DNA片段的末端 C. cDNA克隆中第二鏈 cDNA的合成 D. DNA序列的測定 GAA CTTAA 第三章 基因克隆的載體 引 言（ introduction） 第一節(jié) 質(zhì)粒載體（ plasimid vectors） 第二節(jié) 噬菌體載體（ phage vectors） 第三節(jié) 柯斯質(zhì)粒載體（ cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（ B/Y/HAC） 引 言 基因克隆的本質(zhì) 是使目的基因在特定的條件下得到 擴增和表達 ，而目的基因本身無法進行復制，所以就必須借助于 “載體” 及其 “寄主細胞” 來實現(xiàn)。不過對于雙鏈的降解可被 5′3′的多聚活性所抑制。 B. 5′ 3′外切酶活性 將雙鏈 DNA中游離的 5′末端逐個切去。 Coli 細胞中分離出來的。 影響連接效率的因素有： A. 溫度（最主要的因素） B. ATP的濃度 ( 10?M 1?M ) C. 連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高） D. 反應時間（通常連接過夜） E. 插入片段和載體片段 的摩爾比 轉(zhuǎn)化 4℃ 過夜 加反應液 CK 重組菌落 CK+ 粘性末端 DNA片段的連接 Nick Nick 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段 第三節(jié) DNA聚合酶及其應用 大腸桿菌 DNA聚合酶 I （ E。比如， EcoRI 粘性末端連接部位只有 4個堿基對，很容易斷開。 影響酶活性的因素很多，最重要的有： A. DNA的純度和甲基化程度 B. 甘油的含量（不超過 5%） C. 反應體系中的離子強度 D. 反應體系的 pH值 F. 反應的溫度條件 （通常為 37℃ ） 酶單位的定義和影響酶活性的因素 Buffer (10X) ?L Water ?L DNA ?L Enzyme ?L Volume ?L 酶 切 反 應 的 基 本 步 驟 ＋ － 電泳 紫外分析 37℃ 1h 加反應液 CK M Buffer (10X) ?L Water ?L DNA ?L Enzyme ?L Volume ?L CK M T T DNA連接酶作用的特點 DNA連接酶的反應條件 第二節(jié) DNA連接酶及其應用 DNA連接酶作用的特點 A. 連接的兩條鏈必須分別具有 3′ 端自由羥基（ OH） 和 5 ′ 端磷酸基團（ P），而且只有這兩個基團彼 此相鄰時才能進行連接反應； B. 在羥基和磷酸基團間形成磷
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