分子生物學(xué)研究技術(shù)(理論)-免費閱讀
【正文】 2. 質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹 （ 2） PBR322 This is one of the earliest general purpose cloning vectors to be developed. It is a 4363 bp plasmid with two antibiotic resistance genes, for ampicillin and tetracycline. There are several unique restriction sites. pBR322 generally does not give such a high yield of plasmid DNA as modern vectors such as pUC, pGEM and pBluescript 2. 質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹 pBR322 4363 連接 加反應(yīng)液 Tet or Amp Tet + Amp CK+ 2. 質(zhì)粒載體相關(guān)知識介紹 思考題 1. 什么是限制性核酸內(nèi)切酶，它們是怎樣命名的？ 2. II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性有哪些？ 3. 什么是粘性末端、平末端？ 4. 酶的單位是怎樣定義的，影響酶活性的因素有哪些？ 5. DNA連接酶的作用特點有哪些？ 6. 大腸桿菌 DNA聚合酶 I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用價值。作為基因工程載體，質(zhì)粒至少應(yīng)該具備 復(fù)制的起始區(qū)、選擇標(biāo)記基因區(qū)、多克隆位點 等部分。 （ 2） 質(zhì)粒的大小 差異很大 ，最小的只有 1kb,只能 編碼中等大小的 23種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到 200kb。 C. 3′ 5′外切酶活性 將游離的雙鏈或單鏈 DNA的 3′端降解。 OK NO DNA連接反應(yīng)的條件 連接反應(yīng)最佳溫度為 37℃ ，但是此時粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。 限制性核酸內(nèi)切酶的分類 1. 限制修飾活性 2. 內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu) 3. 限制輔助因子 4. 切割位點 5. 特異性切割 6. 基因克隆中 I 型 單一多功能的酶 3種不同亞基 ATP、 Mg2+和 S腺苷甲硫氨酸 距特異性位點1000bp 不是 無用 II 型 限制酶和修飾酶分開 單一成分 Mg2+ 特異性位點及其附近 是 非常有用 III 型 雙功能酶 2種亞基 ATP、 Mg2+和 S腺苷甲硫氨酸 特異性位點 3’端 2426bp處 是 有用 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成 3個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌 Escherichia coli 表示為 Eco , 流感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示為 Hin； 用一個正體字母表示菌株的類型，比如 EcoR、 Hind； 如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標(biāo)出，比如 Eco R I、 Hind III。 這一年被定為基因工程誕生的元年。 不僅證實了 DNA是遺傳物質(zhì)，而且證明了 DNA可以將一個細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)給另一個細(xì)菌，他的工作被稱為是 現(xiàn)代生物科學(xué)的革命性開端 。 （ 1） S型：注射小白鼠，死亡。 （ 2） S型， 65℃ 加熱：注射小白鼠，活。 Watson 和 Crick DNA雙螺旋模型的提出 50年代， DNA的雙螺旋模型的提出 和 DNA復(fù)制機(jī)理的闡明 DNA是遺傳物質(zhì)已被證實，但是 DNA是怎樣攜帶并傳遞遺傳信息的？在細(xì)胞增殖過程中， DNA是怎樣復(fù)制的？因此，對于 DNA結(jié)構(gòu)的研究成為了當(dāng)時生物學(xué)家研究的熱點。 載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用 Cohen等的重組實驗示意圖 Tcr Ner Eco RI Eco RI 連接酶 Tcr Ner 雙抗重組菌落 基因工程發(fā)展史上首次實現(xiàn)了重組 DNA的細(xì)菌轉(zhuǎn)化 基因工程研究的基本步驟 從生物體中分離得到目的基因（或 DNA片段） 在體外，將目的基因插入能自我復(fù)制的載體中得到 重組 DNA分子。 II型限制性核酸內(nèi)切酶的 3大特點 識別位點的特異性 每種酶都有其特定的 DNA識別 位點，通常是由 6或 7個核苷酸組成的特定序 列（靶序列）。比如， EcoRI 粘性末端連接部位只有 4
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1