分子生物學研究技術(理論)(編輯修改稿)
2025-01-19 03:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 、 DNA連接酶的反應條件 第二節(jié) DNA連接酶及其應用 DNA連接酶作用的特點 A. 連接的兩條鏈必須分別具有 3′ 端自由羥基（ OH） 和 5 ′ 端磷酸基團（ P），而且只有這兩個基團彼 此相鄰時才能進行連接反應； B. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過 程，因此連接反應必須有能量分子的參與，通常有 兩種能量分子，即 ATP和 NAD+。 OK NO DNA連接反應的條件 連接反應最佳溫度為 37℃ ，但是此時粘性末端間氫鍵結合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會迅速降低。比如， EcoRI 粘性末端連接部位只有 4個堿基對，很容易斷開。所以 通常在 416℃ 連接。 影響連接效率的因素有： A. 溫度（最主要的因素） B. ATP的濃度 ( 10?M 1?M ) C. 連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高） D. 反應時間（通常連接過夜） E. 插入片段和載體片段 的摩爾比 轉化 4℃ 過夜 加反應液 CK 重組菌落 CK+ 粘性末端 DNA片段的連接 Nick Nick 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段 第三節(jié) DNA聚合酶及其應用 大腸桿菌 DNA聚合酶 I （ E。 Coli DNA pol I）是 Kornberg A. 1956年首先從大腸桿菌 E。 Coli 細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力： A. 5′ 3′聚合酶活性 以雙鏈 DNA為模板，催化單核苷酸結合到引物的 3′末端，并不斷延伸。 B. 5′ 3′外切酶活性 將雙鏈 DNA中游離的 5′末端逐個切去。 C. 3′ 5′外切酶活性 將游離的雙鏈或單鏈 DNA的 3′端降解。不過對于雙鏈的降解可被 5′3′的多聚活性所抑制。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ T 大腸桿菌 DNA聚合酶 I Klenow片段 第三節(jié) DNA聚合酶及其應用 Klenow片段的主要用途 Klenow片段 大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3′→ 5 ′ 的核酸外切酶活性，但失去了 5′→3′ 的外切酶活性。 Klenow片段的主要用途 A. 修補限制性酶消化 DNA形成的 3′ 隱蔽末端 B. 標記 DNA片段的末端 C. cDNA克隆中第二鏈 cDNA的合成 D. DNA序列的測定 GAA CTTAA 第三章 基因克隆的載體 引 言（ introduction） 第一節(jié) 質粒載體（ plasimid vectors） 第二節(jié) 噬菌體載體（ phage vectors） 第三節(jié) 柯斯質粒載體（ cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（ B/Y/HAC） 引 言 基因克隆的本質 是使目的基因在特定的條件下得到 擴增和表達 ，而目的基因本身無法進行復制，所以就必須借助于 “載體” 及其 “寄主細胞” 來實現(xiàn)。 作為基因克隆的載體必須具備以下特性： A. 能在寄主細胞中進行獨立的復制和表達； B. 具有 12個選擇標記基因，如對抗生素的抗性基因等； C. 具備多克隆位點（ MCS），而且可攜帶外源 DNA片段的長度范圍較寬。 D. 自身分子量較小，在寄主細胞中的拷貝數(shù)高，易于操作和DNA的制備。 Characteristics of vectors for gene cloning MCS Marker Foreign gene 第三章 基因克隆的載體 引 言（ introduction） 第一節(jié) 質粒載體（ plasimid vectors） 第二節(jié) 噬菌體載體（ phage vectors） 第三節(jié) 柯斯質粒載體（ cosmid vectors） 第四節(jié) 人工染色體載體（ B/Y/HAC） 第一節(jié) 質粒載體 （ plasimid vectors） 質粒載體的生物學特性 質粒載體相關知識介紹 （ 1） 質粒 是 一種廣泛從在于細菌細胞中 染色體以 外 的能 自主的復制 的裸露的 環(huán)狀雙鏈DNA分子，比病毒更簡單。在霉菌、藍藻、酵母和一些動植物細胞中也發(fā)現(xiàn)了質
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