分子生物學(xué)研究方法-pcr(編輯修改稿)
2025-01-15 05:12 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 dNTP濃度應(yīng)在 20~200uM, dNTP濃度過(guò)高可加快反應(yīng) 速度。同時(shí)，還可增加堿基的錯(cuò)誤摻入率和實(shí)驗(yàn)成本。反之，低濃度 的 dNTP會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高實(shí)驗(yàn)的精確性。此外，由于 dNTP可能與 Mg++ 結(jié)合，因此應(yīng)注意 Mg++濃度和 dNTP濃度之間的關(guān)系。 （三）．怎樣提高 PCR的特異性 ? 1．熱啟動(dòng)（ hotstart) ? 比如 （ 1）將 Taq酶與其它反應(yīng)體系通過(guò)石蠟分隔開 ? （ 2）利用 Taq酶的單克隆抗體抑制其活性。 ? 2. Touchdown ? 先在高于退火溫度下進(jìn)行幾輪 PCR循環(huán)，然后再在 退火溫度下進(jìn)行大量擴(kuò)增。 ? 3. Nested PCR ? 先在要擴(kuò)增片斷的外側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行 PCR，然后以此PCR產(chǎn)物為模板，再在內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增出我們所要的目的片斷。 二 PCR的應(yīng)用 （ 一）未知 DNA片斷的克隆 1， 基因組 DNA步移法 1 2 3 4 5 已知 DNA序列 接頭 接頭 PCR ? 2， Inverse PCR 限制酶切點(diǎn)（ X） 限制酶切點(diǎn)（ X） 已知序列 限制酶 X酶切 連接 引物 2 引物 1 PCR (二）利用 PCR對(duì)基因功能進(jìn)行 分析和改
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