分子生物學(xué)實驗技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-19 15:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 構(gòu)型不同的 DNA分子?！」矁r閉環(huán)超螺旋 DNA（ cccDNA）＞直線 DNA（ LDNA， 2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀 DNA（ ocDNA， 1條鏈發(fā)生斷裂）。 三、 儀器、材料與試劑 ?（一） 儀器 ?（二）材料 DNA（三）試劑 1． 5 TBE 儲液 () 使用時稀釋 10倍成TBE （ 1TBE 也可）。 2．凝膠加樣緩沖液 %溴酚藍， 50%蔗糖 3. 瓊脂糖 （ EB）， 4℃ 保存。用時稀釋成 5ug/ml的 EB。 四、實驗操作步驟 ? 瓊脂糖凝膠的制備（配制濃度依照所提質(zhì)粒的大小來確定） .? 凝膠板的制備 ? 加樣（加樣體積在 10~30ul）? 電 泳 ? 染色? 結(jié) 果 觀 察 C. 凝膠電泳檢測 DNA的濃度%的瓊脂糖凝膠，100V,40分鐘。?NEB 標準分子量片段(1kb DNA Ladder)1 kb DNA Ladder雖然不能對 DNA質(zhì)量進行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大概的量如下（按 上樣量計。應(yīng)按 13條帶計算，因為 3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段 堿基對 質(zhì)量1 10,002 42ng2 8,001 42ng3 6,001 50ng4 5,001 42ng5 4,001 33ng6 3,001 125 ng7 2,000 48ng8 1,500 36ng9 1,000 42ng10a 517 42ng*10b 500 42ng* 的條帶由 500bp和 517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強度也比較均一。 相關(guān)知識? 電泳：泳動速度決定于？ ? 瓊脂糖凝膠 天然瓊脂（ Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose ，約占 80％）及瓊脂膠（ Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收 ，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。 核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系瓊脂糖濃度 線狀 DNA大小 /kb560 120 核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 ? 不同構(gòu)型 DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)超螺旋DNA（ cccDNA）＞直線 DNA（ LDNA， 2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀 DNA（ ocDNA， 1條鏈發(fā)生斷裂） 。 影響遷移率的因素? DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、 DNA的構(gòu)象、所加電壓 一般 5V/cm、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。常用染料? EB:溴化乙錠（ 3， 8二氨基 5乙基 6苯基菲啶溴鹽Ethidium Bromide， EB）， EB能插入 DNA分子堿基對之間，導(dǎo)致 EB與 DNA結(jié)合。 DNA吸收的 260nm的紫外光傳遞給 EB，或者結(jié)合的 EB本身在 300和 360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以 590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。? EB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下 1520min；不會使核酸斷裂；靈敏度高， 10ng或更少的 DNA即可檢出；可以加到樣品中可膠中。? EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。 EB廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。? SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣 品中，價格較昂貴。五、實驗結(jié)果與討論? 根據(jù)觀察結(jié)果，繪圖。? 分析自提質(zhì)粒的情況。 實驗四、ＤＮＡ的限制性酶切一．實驗?zāi)康募氨尘? 核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈ＤＮＡ中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等動物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來ＤＮＡ的侵襲。? 限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的ＤＮＡ片段５ ’端為Ｐ，３ ’端為ＯＨ。限制酶的類型? 根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 型三大類。? Ⅰ 類和 Ⅲ 類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴 ATP的限制性內(nèi)切酶活性。 ? Ⅰ 類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點，且沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。? Ⅲ 類限制性內(nèi)切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。? 故 Ⅰ 類和 Ⅲ 類酶在基因工程中基本不用。Ⅱ 型酶? Ⅱ 型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶 .? 它們能識別雙鏈ＤＮＡ的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的ＤＮＡ片段； ? Ⅱ 型酶分子量較小，僅需 Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為４～６個堿基對的反轉(zhuǎn)重復(fù)順序； ? Ⅱ 型內(nèi)切酶切割雙鏈ＤＮＡ產(chǎn)生３種不同的切口－－５ ’端突出；３ ’端突出和平末端。? 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)ＤＮＡ進行改造，從而極大地推動了分子生物學(xué)的興旺和發(fā)展。酶切反應(yīng)中應(yīng)注意以下幾個問題：１．內(nèi)切酶：? 不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染；? 注意內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端；? 內(nèi)切酶的用量 根據(jù)內(nèi)切酶單位和ＤＮＡ用量而定，通常 1u指在適當條件下， 1小時內(nèi)完全酶解１ ug特定ＤＮＡ底物所需要的限制性
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