【文章內容簡介】 中提取DNA1. 溶血：加300ul的肝素或EDTA二鈉抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul EP管, 室溫靜置1min,期間，輕輕顛倒混勻10次。13000 ～16000 g離心20秒。2. 棄上清液，將管底的白色沉淀用槍頭吹散，使白細胞在殘留的液體中懸浮。3. 加300ul的Cell Lysis Solution于EP管中, 充分混勻。4. 加100ul的Protein Precipitation Solution于 EP管中, 充分混勻。13000 ～16000 g離心3分鐘 。5. 取上清液，加300ul的異丙醇，充分混勻顛倒50次，可見白色絮狀沉淀，13000 ～16000 g離心1分鐘 。6. 棄上清液，加入70%的酒精500ul，13000 ～16000 g離心1分鐘 。7. 棄上清液，加入DNA Hydration Solution 50ul, 充分混勻，65℃5分鐘使DNA 完全溶解。8. 紫外分光光度計測定OD260/280。（二）、從組織中提取DNA9. 取液氮冷凍的葉片23片， 在液氮冷凍下迅速研磨成粉末。10. ml離心管中，然后加入緩沖液―S‖750ul, 充分混勻。11. 將離心管置于65℃水浴中12小時，水浴過程中溫和混勻幾次。12. 取出離心管, 每管加入等體積的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600700ul，混勻后離心，10000rpm, 10分鐘。13. 上清液移入另一離心管中，加入等體積的氯仿，混勻后，10000rpm, 6分鐘。14. 將上清液移入另一離心管中，輕輕混勻，靜置一段時間，然后用槍頭勾出DNA,并用70％乙醇沖洗2次。15. 勾出的DNA，真空干燥后將其溶于500ul 1x TE中。16. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保溫1 小時。17. 加入等體積的酚氯仿溶液, 輕輕混勻后, 10000rpm離心6分鐘。18. 取上清液，加入等體積的氯仿，輕輕混勻后，10000rpm離心6分鐘。19. 取上清液，入1/10體積3M醋酸鈉，混勻后，加入2倍體積冷的無水乙醇（或95％乙醇）。20. 輕輕混勻靜置一會兒后，用槍頭勾出DNA, 用70％乙醇沖洗2次后，真空干燥。21. 依所提DNA量加入2050ul的1x TE溶解DNA。22. 測定DNA 的濃度，取少量樣品跑電泳, Agarose %。23. 樣品在4℃下保存?zhèn)溆谩８? 提DNA 所用試劑配方：1. 1. 1M (1L：800ml Tris, 用HCl調pH ， 滅菌)2. EDTA pH8 (1L: 800ml EDTANa2 2H2O，用NaOH調 ，定溶至 1 升)3. 20% SDS (2L: 在2L熱水中緩慢加 400g SDS， 邊加邊攪拌，溶解后放置熱地方保存)4. 5M NaCl (1L: 750ml NaCl，溶解后定溶至1升， 滅菌)5. 5. 緩沖液―S‖ 配1L緩沖液―S‖1) 100mM 1M 100ml2) 100mM NaCl 5M NaCl 20ml3) 50mM EDTA EDTA 100ml4) 2% SDS 20% SDS 100ml5) H2O 680ml6. 100x TE (1L: 800ml Tris, EDTA Na2 2H2O, 用HCl調 , 定溶， 滅菌)7. 50x TAE(1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加100ml EDTA ，定溶)8. 蛋白酶K溶液的配制(, pH8, 2mMCaCl2的緩沖液配制濃度為10ug/ul 的蛋白酶K溶液； 或用超純水配制成相同的濃度)9. RNase (用水溶解RNase, 終濃度10mg/ml, 煮沸20分鐘，緩慢冷卻， 分裝，20℃下 保存)10. 10. 3M NaAc (1L: 600ml 3H2O , 溶解后， 然 后定溶1L ，滅菌)五、注意事項不同要求時可選擇不同抽提方法提取DNA 分子生物學與細胞生物學實驗基本技術６ 實驗十一 質粒DNA提取一、目的掌握提取質量DNA提取的原理及方法二、概述質粒DNA 小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA 十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA 有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。三、試劑及材料1. AIQprep miniprep質粒純化試劑盒2. 離心機四、操作步驟1. 從15ml的過夜培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基中分離大腸桿菌，將管底的沉淀用槍頭輕輕打勻。將250ul的buffer P1加入含細胞懸液的EP管中，混勻至不見細胞團塊。2. 加入 250ul的buffer P2輕輕混勻46次。（時間少于5分鐘）3. 加入350ul的buffer N3入EP管中，即刻輕輕混勻46次。4. 13000g離心10分鐘 。5. 將離心后的上清液加入QIAprep管中。13000g離心3060秒。棄液體。6. PB入QIAprep管中，13000g離心3060秒。棄液體。7. PE入QIAprep管中，13000g離心3060秒。棄液體。再13000g離心60秒，去除殘余的液體。8. ，加入 50ul的buffer EB溶解DNA，靜置1分鐘，然后離心1分鐘。 實驗十二 核酸純度、濃度與分子量測定一、目的了解測定核酸濃度、純度的原理和操作方法。二、概述凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性條件下帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同的DNA，其分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。線性DNA樣品在凝膠中的遷移率與DNA的對數(shù)值成反比，可在電泳中加入核酸分子量標準來確定電泳后核酸的分子量。溴化乙錠(ethidium bromide，EB)是一種熒光染料，在凝膠電泳中，EB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)出熒光,其強度與DNA量成正比。同時核酸最大吸收波長在260 nm，在此波長下，吸光度1 A相當于一定濃度的核酸，可以通過A260/A280 的比值，來測定所得核酸的純度。三、材料電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，點樣板，微波爐，瓊脂糖，TBE電泳緩沖液，TE buffer，溴化乙錠（EB），載樣緩沖液，紫外分光光度儀，凝膠圖象分析儀等四、操作步驟（一）、紫外分光光度（Spectrophotometer）法：1. 將分光光度計打開，預熱10分鐘。2. 將核酸溶液中取2181。l，加（或純水）使體積成為100181。l。3. 將稀釋溶液加入石英管，以TE buffer（或純水）為標準倒入另一管。4. 在波長260、280nm處測定吸光值。5. 比較在260nm及280nm之讀值。（三）Ethidium bromide染色法：利用一系列不同濃度的DNA標準溶液（0、50 ng/ml），或已知濃度的DNA marker，和未知濃度DNA樣品一起進行瓊脂糖凝膠電泳，以EB染色后，在凝膠圖象分析儀上觀察，比較標準濃度及未知濃度的亮度，來求取DNA 的含量；比較DNA樣品與DNA marker條帶位置，推知DNA 樣品分子量。實驗步驟主要包括制膠、點樣以及電泳等過程。1. TBE電泳緩沖液三角瓶中，搖勻，在微波爐上加熱至瓊脂糖完全溶解。加入溴化乙錠（EB），并搖勻。2. 用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖倒入，室溫冷卻凝固。3. 充分凝固后撕掉兩端的膠布，垂直向上小心拔出梳子，以保證點樣孔完好。凝膠置入電泳槽中，TBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠12mm。4. 用移液器吸取DNA樣品8μl與 2μl 的載樣緩沖液混勻，小心加入點樣孔，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。同時點10μl DNA Marker作為分子量標準。5. 打開電源開關，調節(jié)電壓至35V/cm，可見到條帶由負極向正極移動，約半小時后即可觀察。6. 在凝膠圖象分析儀上觀察電泳帶及其位置，并與核酸分子量標準比較被擴增產(chǎn)物的大小；同時比較標準濃度及未知濃度的亮度，求取DNA 的含量。五、注意事項A260/A280amp。gt。若數(shù)值amp。lt。amp。lt。，表示純度低，這時由OD260測得的DNA含量較不可信，核酸溶液中含有較多蛋白質，因此最好將前述所得核酸再重新抽取。2. 測定260nm吸光值，OD=：1) ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml2) ss DNA (single stranded DNA or simglestranded RNA) = 40 mg/ml3) oligonucleotide = 33 mg/ml3. EB是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。 分子生物學與細胞生物學實驗基本技術７ 實驗十三 重組質粒DNA轉化大腸桿菌一、目的掌握外源DNA片段和質粒載體的連接反應的方法。二、 概述質粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點。如果要克隆較小的DNA片段(＜10kb＝且結構簡單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性 外源DNA片段: 自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知。2. 載體DNA: pBS質粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知。3. 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α互補能力的菌株。1. 設備2. 恒溫搖床3. 臺式高速離心機4. 恒溫水浴鍋5. 瓊脂糖凝膠電泳裝置6. 電熱恒溫培養(yǎng)箱7. 電泳儀無菌8. 工作臺9. 微量移液槍10. eppendorf管（二）、試劑1. LB固體和液體培養(yǎng)基2. T4 DNA連接酶(T4 DNA ligase)；購買成品。3. Xgal儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解Xgal配制成20mg/ml的儲液, 包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于20℃。4. IPTG儲液(200mg/ml): 在800μl蒸餾水中溶解200mg IPTG后,用蒸餾水定容至1ml,，分裝于eppendorf管并儲于20℃。5. 含AmpLB固體培養(yǎng)基:將配好的LB固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60℃左右,加入Amp儲存液,使終濃度為50ug/ml,搖勻后鋪板。6. 含Xgal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/ml Amp的LB平板表面加40 ul Xgal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置34小時,使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。7. 感受態(tài)細胞制備試劑四、操作步驟(一)、連接反應1. eppendorf管, 編號。2. ，加等摩爾量(可稍多)的外源DNA片段。3. 加蒸餾水至體積為8μl,于45℃保溫5分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至0℃。4. 加入10T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase , 混勻后用微量離心機將液體全部甩到管底,于16℃保溫824小時。5. 同時做二組對照反應，其中對照組一只有質粒載體無外源DNA；對照組二只有外源DNA片段沒有質粒載體。（二）、E. coli DH5α感受態(tài)細胞的制備及轉化每組連接反應混和物各取2μl轉化E. coli DH5α感受態(tài)細胞。（三） 重組質粒的篩選1. 每組連接反應轉化原液取100μl用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37℃下培養(yǎng)半小時以上,直至液體被完全吸收。2. 倒置平板于37℃繼續(xù)培養(yǎng)1216小時,待出現(xiàn)明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出平板。3. 不帶有pBS質粒DNA的細胞,由于無Amp抗性,不能在含有Amp的篩選培養(yǎng)基上成活。帶有pBS載體的轉化子由于具有β半乳糖苷酶活性,在LB篩選培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為紅色菌落。在Xgal和ITPG培養(yǎng)基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了β半乳糖苷酶活性,在LB選擇性培養(yǎng)基和xgal和ITPG培養(yǎng)基上均為白色菌落。（四）、 酶切鑒定重組質粒1. 用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/ml的 5ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時。2. 使用快速分離質粒DNA直接電泳，同時以抽提的pBS質粒做對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較pBS慢。3. 再用與連接未端相