【文章內容簡介】 達。 應用：研究DNA蛋白質相互作用。①確定已知DNA蛋白質之間是否存在相互作用。②分離編碼結合于目的順式調控元件或其他短DNA結合位點蛋白的新基因。③定位已經證實的具有相互作用的DNA結合蛋白的DNA結合結構域以及準確定位與DNA結合的核苷酸序列。 ：該系統(tǒng)是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術，核心在于構建一種反向篩選的報告基因。在這系統(tǒng)中，野生型BDX/ADY間的相互作用激活一種毒性標志作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選。在此情況下BDX/ADY作用的解離賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。利用這種方法能方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關的小分子物質。 應用：1）用于篩選缺陷等位基因的研究：在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質折疊的條件下，已有了幾種遺傳學策略來篩選作用缺陷性等位基因；2）在反式作用解離分子方面的應用；3）在蛋白質組研究方面的應用：利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行預清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質連鎖圖譜的設想。 ：基本原理：構建3個雜交體：1） BD與一個位點特異的RNA結合蛋白融合，可結合到報告基因上；2） RNA(Y)，含有“誘餌”順序，且可結合到BD融合的蛋白質上；3）與AD融合的X蛋白。若X蛋白能與RNA結合，則AD靠近報告基因，使其激活。 種類：兩個融合蛋白的相互作用必須借助于第三種分子，而這第三種分子可以是蛋白質、小分子多肽和核酸，因而產生了：1）蛋白質三雜交系統(tǒng)；2）激酶三雜交系統(tǒng)；3）小配體三雜交系統(tǒng)；4）RNA三雜交系統(tǒng)。六、DNA重組\雜交1. DNA重組技術基本程序：外源DNA的獲取克隆載體的選擇與構建目的基因與載體的連接 DNA導入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達 ：分、切、接、轉、篩。：(1)有自身的復制子，能借助自身的復制和調控對攜帶的目的基因進行復制和增殖。(2)有多克隆位點(多種酶單一位點)，易于外源DNA分子與載體及重組。(3)有多個利于選擇和篩選的遺傳表型或標志，包括抗藥性、營養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應。(4)表達型載體還應有強啟動子、前導序列、增強子等調控元件。：（一）按功能分類：1）克隆型載體； 2）表達型載體。 （二）按受體細胞分類：1）原核細胞載體：原核克隆型載體，原核表達型載體； 2）真核細胞載體（穿梭載體）：真核表達型載體，真核轉遞型載體。 （三）按載體來源分類：質粒載體，噬菌體載體，病毒載體，酵母人工染色體，粘性載體。：1）分子相對較小，具有較高的拷貝數； 2）含高效的復制子，可用氯霉素阻止細菌蛋白 質的合成，非使質粒的拷貝數增加；3）具有多種遺傳選擇標記，包括各種抗藥基因或營養(yǎng)代謝基因等。：1）氨芐青霉素抗性基因（ampr）:編碼β內酰胺酶，水解amp β內酰胺環(huán)使amp失效；2）四環(huán)素抗性基因（tetr）：編碼轉膜泵將tet從細胞移出； 3）大腸桿菌LacZ基因：編碼半乳糖苷酶，分解Xgal，使菌落為藍色。：① l噬菌體生長繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌體基因組中央含有30%的DNA是l噬菌體生長所非必需的。② l噬菌體的成熟需要包裝，當與外源DNA重組后的大小介于原來的75%～105%之間時，重組的DNA分子才可包裝為成熟的噬菌體顆粒。(YAC)：1）酵母基因：著絲粒，端粒，自主復制順序； 2）質粒pBR322衍生物：復制起點(ori)，Ampr基因。 用途：構建真核生物基因組DNA文庫：1）標準的酶切體系：1μgDNA，20μl總反應體積，1U酶，推薦的Buffer和溫度，反應1h； 2）酶切體系組成：內切酶 根據實驗目的選擇，保存，使用，稀釋（避免失活與污染）； DNA底物純度，含量； 反應buffer 嚴格按產品說明書 高、中、低鹽； 3）酶切溫度與時間：一般為37℃, 1h； 4）酶切反應過程：容積：20μl，50μl, 酶容積≤10%, 即甘油≤ 5%；注意混勻；反應終止：三種方法 :①10mM %SDS。 ②65℃，20min。 ③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀； 酶切鑒定 ：瓊脂糖凝膠電泳：大腸桿菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→ 3′外切酶活性。用途：1）隨機引物標記法標記探針主要用途；2）雙脫氧末端終止法進行DNA測序；3）cDNA第二鏈的合成；4）DNA 3′突出末端進行末端標記(DNA ligase)——基因工程的縫紉針：催化雙鏈DNA相鄰堿基5′P和3′OH間磷酸二酯鍵形成的酶。 主要功能與用途：①催化兩個獨立DNA片段(粘性末端和平末端) 5′P和3′OH之間形成磷酸二酯鍵。催化平末端連接要比粘性末端 效率低得多。②修復雙鏈DNA分子中單鏈缺口。(TdT)：功能：催化多個脫氧核苷酸依次加到單鏈或雙鏈DNA分子的3′OH末端。 用途：1）主要作用是在載體或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重組。 2）DNA 3′末端的同位素標記。：催化DNA，RNA以及核糖和脫氧核糖三磷酸上的 5′ 磷酸基團水解。 用途：1. 在連接反應中去除載體DNA片段5′P，防止載體自我連接. 2. 用32P標記5′末端時，用此酶去除5′P，再用激酶進行5′的 32P標記.：1）基因組文庫(G文庫)用基因克隆的方法保存宿主細胞中的DNA重組分子中的集合, 所有重組子所含的插入片段的總和代表某種生物基因組全部核苷酸序列； 2）G文庫構建方法：鳥槍法； 3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術。：1）cDNA文庫(C文庫)用基因克隆的方法保存在宿主細胞中的DNA重組體的群體，每一重組子只含一種mRNA信息，這些重組子的總和包含某種生物的全部mRNA序列。2）C文庫構建方法：反轉錄法合成的cDNA與合適的載體重組并導入宿主細胞而形成。3）分離、篩選基因方法：分子雜交及探針技術。：1）使用DNA合成儀。2）適用于氨基酸殘基數目較少的蛋白基因。3）缺點：只能合成較小片段的DNA；目的基因DNA序列需通過氨基酸序列推測，難于保證與天然基因序列一 致，導致表達效率大大降低。：1）限制性內切酶酶切位點添加法； 2）T/A克隆法：1）粘性末端連接法：適用于插入片段和載體具有相同的粘性末端。 缺陷：高背景(自身環(huán)化)；雙向(正、反)插入；多拷貝插入。 2）平頭末端連接法：適用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。3）人工接頭法：用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。4）同聚物接尾法：適用于在質粒和目的基因上沒有相同的酶切位點。、轉染程序：對數生長期的細菌――― 感受態(tài)細菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培養(yǎng)重組質粒DNA+細菌熱休克蛋（42度，90秒）普通培養(yǎng)基溫育涂布于含抗生素的培養(yǎng)基平板單菌落20. Southern印跡雜交是將經凝膠分離的DNA轉移到合適的固相支持物，再通過特異性探針的雜交來檢測被轉移的DNA片段的一種技術。 程序： 限制性內切酶消化DNA→瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段→轉印到NC膜或尼龍膜→堿變性、中和→預雜交、雜交→放射性自顯影. 其基本原理毛細管轉移: 將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉移到NC膜等固相載體上，用標記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進行雜交。：相同點：基本原理。 不同點：(變性方法) Northern印跡雜交：聚乙二醛、二甲亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞。 Southern印跡雜交：堿變性: 用一已知的DNA或RNA片段(探針)來檢測樣品中未知的核苷酸序列，通過核苷酸間堿基互補的原理互相結合，再經顯影或顯色的方法，將結合核苷酸序列的位置和大小顯示出來。具有一定同源性的兩條核酸單鏈在適宜的條件（溫度及離子強度）下可以按堿基互補配對的原則退火形成雙鏈分子，由此可用來檢測核酸分子存在與否。 實質是核酸分子的變性與復性過程。 核酸分子雜交應用：1）基因克隆的篩選；2）酶切圖譜的制作；3）基因組中特定基因序列的定量和定性分析；4）基因突變分析；5）疾病的診斷。：1）寡核苷酸探針；2）基因組DNA探針；3）cDNA探針；4）RNA探針。:(1).高度靈敏性。(2).標記物與核酸探針分子的結合，不影響探針的主要理化特性，絕對不能影響其堿基對特異性。(3).具有較高的化學穩(wěn)定性，能耐較高溫度和保存時間。(4).檢測方法具有高度特異性。(5).標記及檢測方法簡單。(6).對環(huán)境無污染，對人體無損傷。(7).價格低廉。：優(yōu)點：1）靈敏度極高；2）放射性核素對各種酶促反應無任何影響,也不會影響堿基配對的特異性與穩(wěn)定性和雜交性質；3）極高的特異性。 缺點：1）半衰期短, 隨用隨標；2）放射性污染。非放射性標記物：優(yōu)點：1）無放射性污染；2）穩(wěn)定性好,可較長時間存放。 缺點：1）靈敏度不太高；2）特異性不太高。 非放射性標記物：1）生物素；2）地高辛；3）熒光素：FITC，羅丹明。:(1)DNA的切口平移標記法。(2)隨機引物標記法。(3)RNA探針的標記。(4)DNA的末端標記。(5)cDNA探針的標記：在反轉錄過程中選用反轉錄酶, 加入標記的核苷酸, 引物可以特定的,也可以是隨機六核苷酸, 或oligo dT。(6)寡核苷酸探針的標記：在DNA合成時加入特定標記的核苷酸進行標記。，隨機引物標記法，DNA的3′末端標記等均為延長核苷酸的反應，而且要讓32P進入鏈中，故應選擇[α32P]dNTP， 50μci/反應，無特殊原因首選[α32P]dCTP?！淠┒藰擞?，為加磷酸反應，而且要讓p/32P進入5′末端，故應選擇[γ32P]ATP， 150μci/反應。:酶法(U)與化學法(C)生物素標記方法:參入標記法(隨機引物法或缺口翻譯法)與光敏生物素標記法。生物素探針的檢測體系：①生物素探針+抗生物素蛋白+帶ALP或HRP的生物素+底物；②生物素探針+抗生物素抗體+ 抗生物素抗體的抗體+ABC試劑(底物:BCIP+NBT)。:Dig+dUTP→ DigdUTP DigdUTP標記DNA方法: 切口平移法與隨機引物標記法檢測方法: DigDNA探針+抗Dig抗體ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）。：1）毛細管轉移；2）電轉移法；3）真空轉移法。七、DNA的P C R：類似于DNA的天然復制過程，是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5`末端和3`末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸，直至完成新的DNA合成，反復重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。PCR反應的特異性依賴于2個與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，取決于2個引物設計的好壞，依賴于引物與模板結合的正確性，退火溫度。：(1)．DNA模板變性 (denature)：95℃左右高溫使模板DNA完全變性。(2)．單鏈DNA模板與引物退火 (annealing)：引物與模板形成復合物的幾率DNA分子自身的復性。(3)．引物的延伸 (extension)：DNA聚合酶在最適溫度下催化DNA合成反應。5 39。端是人工合成的引物，是特定的，3 39。端沒有固定的終止點。：1）高度的敏感性：是最主要的特點，25個循環(huán)可擴增106倍，它可對單拷貝、單根頭發(fā)、一滴血等微量標本進行分析；2）高度的特異性：取決于2個引物設計的好壞，依賴于引物與模板結合的正確性，退火溫度；3）操作簡便、快捷；4）適用樣品的廣泛性。：1）寡核苷酸引物。引物的常用濃度范圍：～1μmol/L，在100μl中引物的量為25～100 pmol, 假如用25μmol/L濃度的引物貯備液只需加1～ 4μl。 配制時注意:① 由于引物呈很輕的干膜狀附在管壁上,打開時極易散失, 故打開管子前要先離心, 再慢慢打開,溶解時加足量水后蓋蓋,充分上下振蕩5～10min② 溶解后分裝, 凍存于20℃；2） PCR反應緩沖液：TrisCl（pH ～)； KCl或(NH4)2SO4:促使引物退火； MgCl2:影響酶活與精確度,產物的特異性； 明膠或BSA或Tween20:穩(wěn)定酶活性； 甲酰胺:使引物與模板特異性配對；3）耐熱DNA聚合酶；4）dNTP：常用濃度是20～200μmol/L；避免反復凍融, 分裝凍存于20℃；5）模板DNA：抽提方法：簡單的水煮沸法，去垢劑裂解細胞→蛋白酶消化蛋白→有機溶劑抽提→乙醇沉淀核酸。：1）引物長度在15～30個堿基；2）引物的堿基的分布是隨機的, 避免5個以上的嘌啶和嘧啶的連續(xù)排列, 尤其3 39。不應有連續(xù)3個G或C；3）避免兩引物間的互補,特別是3 39。端；4）引物自身不應有連續(xù)超過3個bp的互補序列；5）引物的3 39。端不能有任何修飾, 3 39。決定產物的特異性；6）引物的5 39。端限定PCR產物的長度, 5 39。端可進行修飾；7）引物與非擴增序列同源性應70%或連續(xù)8個互補；8）擴增編碼區(qū)中,引物3 39。端不要終止于密碼子的第3位?！捌脚_效應”出現的早晚取決于：1。Taq聚合酶的性能；2。模板DNA的拷貝數；3。底物dNTP濃度；4。其他多種因素7. PCR的條件優(yōu)化：1）PCR循環(huán)數；2）使用增強劑（DMSO，PEG6000，甲酰胺，甘油，Tween20）；3）熱啟動PCR。：1）基因分析：（一）基因缺失的檢測；（二）基因突變的檢測；（三）基因易位的檢測；（四）外源致病基因的檢測；2）定位克?。?）序列分析。八、外源基因的表達：酵母、昆蟲（果蠅與非果蠅類）、哺乳動物。:1)病毒感染。 2)轉染:（一）化學法:磷酸鈣共沉淀法, DEAE葡聚糖轉染法, 脂質體介導法, 醋酸鋰法. （二）物理法:電穿孔技術, 顯微注射技術.：1）瞬時表達（瞬時轉染），特點：外源DNA未與宿主染色體整合，維持時間短(23天)； 2）穩(wěn)定表達（穩(wěn)定轉染），特點：外源DNA已整合入宿主細胞染色體, 其轉染的目的是獲得穩(wěn)定表達外源目的基因的單細胞克隆。：1）質粒型載體，組成：啟動子，增強子，多聚腺苷酸化信號：穩(wěn)定mRNA，保證基